Subjekter og billeddannelsesprocedurer
Eksperiment 1 (3,0 T): Tyve sunde voksne (11 mænd, alder 26.2 ± 3.1 år) gav informeret samtykke til at deltage i eksperimentet. Dataene for 16 deltagere er allerede blevet rapporteret i vores tidligere undersøgelse15. Fire deltagere blev nyligt rekrutteret til denne undersøgelse. Udelukkelseskriterierne omfatter en betydelig psykiatrisk eller neurologisk historie. Denne undersøgelse blev godkendt af University of Toronto Research Ethics Board (REB) og SickKids hospital REB. Der blev ikke foretaget nogen statistisk test for at bestemme stikprøvens størrelse på forhånd. De stikprøvestørrelser, vi valgte, svarer til dem, der er anvendt i tidligere publikationer16, 26. Forsøget blev udført ved hjælp af et 3,0 T fMRI-system (Siemens Trio). Localizer-billeder blev først indsamlet for at justere synsfeltet (FOV) centreret på hver deltagers hjerne. T1-vægtede anatomiske billeder blev indhentet (1 mm3, 256 × 256 FOV; MPRAGE-sekvens) før de eksperimentelle echo-planare billeddannelseskørsler (EPI). Til funktionel billeddannelse blev der anvendt en gradient echo-planar sekvens (gentagelsestid (TR) = 2000 ms; ekkotid (TE) = 27 ms; flipvinkel = 70°). Hver funktionel kørsel bestod af 263 helhjerneoptagelser (40 × 3,5 mm skiver; interleaved opsamling; FOV = 192 mm; matrixstørrelse = 64 × 64; opløsning i plan på 3 mm). De første fire funktionelle billeder i hver kørsel blev udelukket fra analyse for at give mulighed for udligning af langsgående magnetisering.
Eksperiment 2 (7.0 T): Elleve sunde voksne (6 mænd, alder 22.2 ± 2.2 år) gav informeret samtykke til at deltage i eksperimentet. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for det nationale institut for fysiologiske videnskaber i Japan. Der blev ikke foretaget nogen statistisk test for at bestemme stikprøvens størrelse på forhånd. De stikprøvestørrelser, vi valgte, svarer til dem, der er anvendt i tidligere publikationer16, 26. Forsøget blev udført ved hjælp af et 7,0 T fMRI-system (Siemens Magnetom). Localizer-billeder blev først indsamlet for at justere FOV centreret på hver deltagers hjerne. T1-vægtede anatomiske billeder blev opnået (0,75 mm isometrisk, 224 × 300 FOV; MPRAGE-sekvens). Til funktionel billeddannelse blev der anvendt en gradient echo-planar sekvens (TR = 500 ms; TE = 25 ms; flipvinkel = 35°; multibandfaktor = 4). Hver funktionel kørsel bestod af 1010 helhjerneoptagelser (32 × 2,0 mm skiver; interleaved opsamling; FOV = 208 mm; matrixstørrelse = 104 × 104; opløsning i plan på 2 mm). De første fire funktionelle billeder i hver kørsel blev udelukket fra analyse for at give mulighed for udligning af langsgående magnetisering.
Adfærdsprocedurer
Experiment 1: Gustatory stimuli blev leveret af plastikrør, der konvergerede ved en plastikmanifold, hvis dyse dryppede smagsopløsninger ind i munden. Rørene blev påfyldt på forhånd, således at der næsten ingen forsinkelse var mellem præsentationen af den visuelle stimulus og væsketilførslen. Et hundrede forsøg med smagsopløsning blev randomiseret og afbalanceret på tværs af fem kørsler. I hvert forsøg blev der afgivet 0,5 mL smagsopløsning i løbet af 1244 ms. Når væsketilførslen sluttede, instruerede en skærm deltagerne om at sluge væsken (1 s). Efter 7756 ms dukkede der skaleringsbjælker op for at vurdere positivitet (3 s) og derefter negativitet (3 s) af væsken. Dette blev efterfulgt af 0,5 mL af den smagløse væske i 1244 ms til skylning, efterfulgt af 1 s instruktion om at sluge. Efter et 7756 ms inter-trial-interval begyndte det næste forsøg.
Eksperiment 2: I sammenligning med forsøg 1 adskilte den gustatoriske stimulustilførsel sig kun i deres timing og mængde. Et hundrede smagsløsningsprøver blev randomiseret og afbalanceret på tværs af fem kørsler. I hvert forsøg blev 0,88 mL smagsopløsning leveret over 2 s. Når væsketilførslen sluttede, instruerede en skærm deltagerne om at sluge væsken (2 s). Efter 4000 ms dukkede der skaleringsbjælker op for at vurdere positivitet (3 s) og derefter negativitet (3 s) af væsken. Dette blev efterfulgt af 0,88 mL af den smagløse væske, der blev leveret i løbet af 2 s til skylning, efterfulgt af instruktionerne om at sluge på 2 s. Efter et 7 s inter-trial-interval begyndte det næste forsøg.
Foreksperimentel session
Foreksperiment 1: For at tage hensyn til individuelle forskelle i deres subjektive oplevelser af forskellige smagsoplevelser blev deltagerne bedt om at smage et bredere spektrum af intensiteter (målt ved molære koncentrationer) af de forskellige smagsopløsninger (surt, salt, bittert og sødt). I denne præeksperimentelle session blev deltagerne testet for 1 forsøg (2 mL) af hver af de 16 smagsopløsninger på følgende måde: (1) surt/citronsyre: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M og 1,0 × 10-2 M; (2) salt/kostsalt: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M og 1,0 × 10-1 M; (3) bitter/chininsulfat: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M og 7,8 × 10-6 M; og (4) sød/sukrose: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M og 7,8 × 10-6 M; og (5) sød/sukrose: Præsentationsrækkefølgen blev randomiseret efter smag og derefter efter koncentration inden for hver smag. Efter at have drukket hver opløsning skyllede deltagerne og slugte 5 mL vand og vurderede derefter intensiteten og behageligheden (valens) af oplevelsen af opløsningen på separate skalaer fra 1-9. De koncentrationer for hver smag, der matchede i intensitet, blev udvalgt. Tidligere arbejde2 havde vist, at deltagerne har forskellige vurderingsbasislinjer, og at de koncentrationer, der vælges mest pålideligt, er over middelstor selvrapporteret intensitet. Alle opløsninger blev blandet ved hjælp af kemiske forbindelser af farmaceutisk kvalitet fra Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), der er sikre til konsum.
Eksperiment 2: Deltagerne blev testet for 1 forsøg (1 mL) af hver af de 16 smagsopløsninger som følger: (1) sød 1/glukose: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M og 0,38 M; (2) sød 2/sukralose: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M og 0,26 × 10-4 M; (3) bitter 1/catechin: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M og 4,4 × 10-3 M; og (4) bitter 2/magnesiumchlorid: 0,4 M, 0,2 M, 0,1 M og 0,05 M. Rækkefølgen af præsentationen blev randomiseret efter smag og derefter efter koncentration inden for hver smag. Efter at have drukket hver opløsning skyllede deltagerne og slugte 5 mL vand, hvorefter de vurderede intensiteten og behageligheden (valens) af oplevelsen af opløsningen på separate skalaer fra 1-9. De koncentrationer for hver smag, der matchede i intensitet, blev udvalgt. Alle opløsninger blev blandet ved hjælp af kemiske forbindelser af fødevarekvalitet fra DHC (cathechin), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (magnesiumchlorid), Tsuruya Chemical Industries (sucralose) og Nichiga (glukose).
Dataanalyse
Data blev analyseret ved hjælp af SPM8-software (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Funktionelle billeder blev omjusteret, skivetidskorrigeret og normaliseret til MNI-skabelonen (ICBM 152) med interpolation til et 2 × 2 × 2 × 2 mm-rum. Data blev rumligt udglattet (fuld bredde, halvt maksimum (FWHM) = 6 mm) for univariat parametrisk modulationsanalyse, men ikke for multivoxelmønsteranalyse, da det kan forringe ydeevnen19. Hver stimuluspræsentation blev modelleret som en separat begivenhed ved hjælp af den kanoniske funktion i SPM8. For hver voxel blev t-værdierne for individuelle forsøg nedtonet ved at trække den gennemsnitlige værdi på tværs af forsøg fra. For at visualisere billeddannelsesresultaterne blev freesurfer software39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) og SPM surfrend toolbox (skrevet af I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) anvendt efter modifikation.
Univariate analyse
Vi udførte univariate analyser for at undersøge, om grundlæggende smag blev kodet af specifikke voxels i insulaen. Regressorer, der kodede hver smagstype, blev tidslokaliseret til stimuluspræsentation. Univariate analyser blev udført to gange: med og uden hedoniske valensregressorer (Fig. 1). For at visualisere, hvor meget varians der kunne forklares af hedoniske valensregressorer i de bitterfølsomme regioner, valgte vi signifikante voxels i kontrasten “bitter vs. smagløs” uden valens regresseret ud (Supplerende figur 1). Gennemsnitlig aktivitet blev vist for aktivitet mod hvilende basislinje (Supplerende figur 1a), aktivitet mod smagløs (Supplerende figur 1b) og aktivitet mod smagløs med valens regresseret ud (Supplerende figur 1c). For at teste eksistensen af voxel-specifik smagstuning opdelte vi hver deltagers ulige og lige kørsler og sammenlignede voxelaktiviteten for hver smag i de ulige kørsler med voxelaktiviteten for hver smag i de lige kørsler. Til illustration, når voxels blev rangordnet på baggrund af aktivering til hver smag i lige løb, fandt vi konsekvente mønstre af tilsvarende faldende aktivering for alle fire smagsoplevelser i ulige løb (Fig. 1b, Supplerende figur 4). Korrelationer blev beregnet for voxelaktivering mellem ulige og lige løb mellem alle smagskombinationer inden for hver deltager, der blev underkastet en enkelt stikprøve t-test på tværs af deltagere (Fig. 1c, Fig. 4a, b). Vi beregnede yderligere korrelationer mellem ulige og lige løb for alle samme smag og forskellige smagskombinationer inden for hver deltager. Korrelationskoefficienter blev z-transformeret og underlagt et-stikprøve t-test på tværs af deltagere (Fig. 1d, Fig. 4b, d).
Searchlight-analyse for smagstyperepræsentationer
Vi analyserede fMRI-data fra den insulære cortex ved hjælp af searchlight-analyse (radius på 4 mm, herunder 33 voxels) 20. Inden for en given kugle for hver deltager blev der oprettet en vektor, der indeholdt det rumlige mønster af BOLD-MRI-signalet tidslokaliseret til stimuluspræsentation (normaliserede t-værdier pr. voxel). For at evaluere, om aktivitetsmønstrene i søgelys-sfærerne er i stand til at skelne smagstyper, anvendte vi en leave-one-stimulus-pair-out cross-validation40. I denne procedure blev LDA-klassificatoren trænet på 38 forsøg, som omfattede den testede smagstype og en anden smagstype (19 forsøg for hver), og derefter testet på det udeladte stimuluspar. Klassificeringspræstationen for hver smag blev gennemsnitliggjort på tværs af sammenligninger med andre smagsvarianter (f.eks. blev sur klassifikationspræstationen for sur gennemsnitliggjort på tværs af sur vs. sød, sur vs. bitter, sur vs. salt og sur vs. usmagelig). På individniveau svarede 58,7 % klassifikationsnøjagtighed til p < 0,05 ukorrigeret. Til gruppeanalyse blev de individuelle klassificeringspræstationskort udglattet med en 4 mm FWHM-gaussisk kerne og derefter underkastet en permutationstest med ét stikprøve ved hjælp af SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). I denne procedure blev dataene fra hver deltager vendt tilfældigt ved at multiplicere – 1 efter at have fratrukket 50 % (tilfældig nøjagtighed) og derefter underkastet en t-test med én stikprøve på tværs af deltagerne. Dette blev permuteret 10.000 gange, hvilket resulterede i fordelingen af maksimal t inden for insulaen. Baseret på denne fordeling blev tærsklen for 5% FWE bestemt.
Smagskonjunktionsanalyse
For multi-smagskonjunktionsanalyse (Fig. 2b) blev hver voxel testet på, om den overskred tærsklen for de fire smagstype-diskriminationer, hvor hver smagstype-diskrimination gennemsnitlig klassificeringspræstation på tværs af fire sammenligninger (f.eks. surt vs. sødt, surt vs. bittert, surt vs. salt og surt vs. smagløst), der oversteg chanceklassificering (50%). Gyldig konjunktionsslutning kræver signifikante resultater for alle sammenligninger41. Vi talte således antallet af smagstyper, der opfylder 5% FWE-tærsklen i hver voxel inden for insula.
Smagsparanalyse
For analyse af specifikke smagspar undersøgte vi en uafhængigt defineret ROI inden for insulaen. Først anvendte vi en leave-one-subject-out-procedure, idet vi udelukkede hver af 20 emner og derefter beregnede et 4-smagskonjunktionskort (dvs. voxels, der opfylder alle 4 smagskontraster, der er beskrevet ovenfor) med de resterende 19 emner, hvilket resulterede i 20 kort. Overlapningen af disse 20 gruppekort er vist i fig. 2c. Voxellerne fra kortet, der opfylder 5% FWE-tærsklen, blev defineret som den ROI, der er i stand til smagsdiskrimination. Inden for denne ROI undersøgte vi diskrimination af specifikke smagspar, idet vi beregnede klassifikationspræstationerne for hvert smagspar. Gruppepræstation blev beregnet som den gennemsnitlige klassifikationspræstation på tværs af 20 emner (Fig. 2d).
For smagspar-diskrimination baseret på vurderinger af valens (Fig. 2e) udførte vi en LDA-analyse ved hjælp af emnevurderinger af valens (dvs. uafhængig af fMRI-data). Valence blev beregnet ved at subtrahere negativitetsvurdering fra positivitetsvurdering for hvert forsøg. Smagsklassificering blev beregnet ved hjælp af en leave-one-trial-out trænet på de 19 resterende forsøg for hver smagstype.
Valence- og smagstypeanalyse
For at teste uafhængigheden af smagstype fra valens undersøgte vi ligheden af fMRI-data inden for ROI’en defineret af det fire-smagskonjunktionskort ovenfor. For hvert emne blev forsøg for forsøgskorrelationer beregnet, hvilket resulterede i 4950 (100 × 99/2) korrelationskoefficienter, sorteret i 2 × 2-kategorier af smagstype (samme, forskellig) × hedonisk valens (samme, forskellig). Korrelationskoefficienterne blev gennemsnitliggjort inden for hver celle pr. Emne, hvorefter alle emners data blev underkastet en tovejs gentagne foranstaltninger ANOVA med smagstype og valens som faktorer (Fig. 2g).
Vi udførte yderligere en opfølgende analyse uden dataafhængighed i prøve-for-prøve-korrelationerne på tværs af de 2 × 2-celler. Vi befolkede tilfældigt hver celle med de 100 forsøg og gentog denne procedure 1,000,000 gange. Ud fra disse analyserede vi den permutation med den største kongruens mellem 2 × 2-faktorerne og de faktiske forsøgskategorier (baseret på det maksimale geometriske gennemsnit af andelen af de reducerede data på tværs af de fire celler). Vi beregnede derefter korrelationer på tværs af forsøg kun inden for hver celle, hvilket sikrede ingen afhængighed på tværs af cellerne. Korrelationskoefficienterne blev gennemsnit inden for hver celle pr. Emne, hvorefter alle resterende emners data blev underkastet en tovejs ANOVA med gentagne foranstaltninger (Supplerende figur 3).
Smagstypemønstre adskilte sig uafhængigt af smagsvalens, dvs. smagsdiskriminationskort var dissocierbare fra palatabilitet. På grund af den stærke sammenhæng mellem smagstype og valens var forsøgskombinationer ikke ens på tværs af niveauerne. For eksempel var samme valens med forskellige smagstyper relativt sjældne (Supplerende tabel 4). Dette indikerer imidlertid ikke multikollinearitet i effektstørrelse.
Statistik
Vi analyserede dataene uden at antage normalfordeling ved hjælp af ikke-parametrisk statistik. Før ANOVA (fig. 2g) blev Levenes test udført for at sikre, at antagelsen om homoscedasticitet var opfyldt. Korrektioner for flere sammenligninger blev anvendt ved hjælp af Bonferroni-korrektion.
Rapporteringsresumé
Flere oplysninger om eksperimentelt design er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.
