En histonmodifikation er en kovalent posttranslationel modifikation (PTM) af histonproteinerne, som omfatter methylering, fosforylering, acetylering, ubiquitylering og sumoylering. De PTM’er, der foretages på histoner, kan påvirke genekspressionen ved at ændre kromatinstrukturen eller rekruttere histonmodifikatorer. Histonproteiner fungerer som pakker for at pakke DNA, som er viklet rundt om de otte histoner, ind i kromosomer. Histonmodifikationer virker i forskellige biologiske processer som f.eks. transkriptionel aktivering/inaktivering, kromosompakning og DNA-skader/reparation. I de fleste arter er histon H3 primært acetyleret ved lysin 9, 14, 18, 23 og 56, methyleret ved arginin 2 og lysin 4, 9, 27, 36 og 79 og fosforyleret ved ser10, ser28, Thr3 og Thr11. Histon H4 er primært acetyleret ved lysin 5, 8, 12 og 16, methyleret ved arginin 3 og lysin 20 og fosforyleret ved serin 1. Kvantitativ påvisning af forskellige histonmodifikationer vil således give nyttige oplysninger til en bedre forståelse af epigenetisk regulering af cellulære processer og udvikling af lægemidler rettet mod histonmodificerende enzymer.
Histonacetylering/Deacetylering
Histonacetylering sker ved enzymatisk tilføjelse af en acetylgruppe (COCH3) fra acetylcoenzym A. Histonacetyleringsprocessen er tæt involveret i reguleringen af mange cellulære processer, herunder kromatin-dynamik og -transkription, gen-stumring, cellecyklus-progression, apoptose, differentiering, DNA-replikation, DNA-reparation, nukleær import og neuronal repression. De modificerende enzymer, der er involveret i histonacetylering, kaldes histonacetyltransferaser (HAT’er), og de spiller en afgørende rolle i kontrollen af histon H3- og H4-acetylering. Der er blevet identificeret mere end 20 HAT’er, som kan inddeles i fem familier: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP og nukleare receptor-koaktivatorer såsom ACTR.1 Histon H3-acetylering kan øges ved hæmning af histon-deacetylaser (HDAC’er) og mindskes ved hæmning af HAT’er.
Histon-deacetylaser (HDAC’er) katalyserer den hydrolytiske fjernelse af acetylgrupper fra histonlysinrester. En ubalance i ligevægten af histonacetylering er blevet forbundet med tumorigenese og kræftfremskridt. Påvisning af, om histon H3 er acetyleret på sine lysinrester, vil give nyttige oplysninger til yderligere karakterisering af acetyleringsmønstre eller -steder og dermed føre til en bedre forståelse af epigenetisk regulering af genaktivering samt til udvikling af HAT-målrettede lægemidler. I lighed med HAT’er spiller HDAC’er en kritisk rolle i forskellige cellulære processer, der involverer histon H3 og H4. Indtil videre er der blevet identificeret mindst fire klasser af HDAC’er. HDAC’er i klasse I omfatter 1, 2, 3 og 8. HDAC’er i klasse II består af 4, 5, 6, 7, 9 og 10. Klasse III-enzymer, kendt som sirtuiner, kræver NAD+-kofaktorer og omfatter SIRT’erne 1-7. Klasse IV-enzymet, som kun indeholder HDAC11, har træk fra både klasse I og II. HDAC-hæmning har en betydelig virkning på apoptose, cellecyklusstop og differentiering i kræftceller. HDAC-hæmmere er i øjeblikket under udvikling som midler mod kræft.2
Udtræk dine nukleare proteiner fra din prøve af interesse, og benyt derefter en ELISA-lignende metode til at måle mængden af HDAC-proteiner eller aktivitetsniveauet af HDAC eller aktivitetsniveauet af HAT.
Histonmethylering/Demethylering
Histonmethylering er defineret som overførsel af en, to eller tre methylgrupper fra S-adenosyl-L-methionin til lysin- eller arginininrester af histonproteiner af histonmethyltransferaser (HMT’er). HMT’er kontrollerer eller regulerer DNA-methylering gennem kromatinafhængig transkriptionel repression eller aktivering. Når histonmethylering finder sted i cellekernen, kan specifikke gener i det DNA, der er komplekseret med histonet, aktiveres eller lukkes ned.3 Der findes flere forskellige histonmethyltransferaser, som er specifikke for den lysin- eller arginininrest, som de modificerer. På histon H3 er f.eks. SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx og SMYD3 histonmethyltransferaser, der katalyserer methylering af histon H3 ved lysin 4 (H3-K4) i pattedyrceller. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 og Eu-HMTase er histonmethyltransferaser, der katalyserer methylering af histon H3 ved lysin 9 (H3-K9) i pattedyrceller. G9a og enzymer fra polycomb-gruppen såsom EZH2 er histonmethyltransferaser, der katalyserer methylering af histon H3 ved lysin 27 (H3-K27) i pattedyrceller.4 Både H3-K9- og H3-K27-methylering medierer dannelse af heterokromatin og deltager også i at dæmpe genekspression på euchromatiske steder. Øget global H3-K27-methylering har også vist sig at være involveret i nogle patologiske processer såsom kræftprogression.
På den anden side fremmer argininmethylering af histonerne H3 og H4 transkriptionel aktivering og medieres af en familie af protein argininin methyltransferaser (PRMT’er). Der findes 9 typer PRMT’er i mennesker, men kun 7 medlemmer er rapporteret til at methylerer histoner. De kan formidle mono- eller dimethylering af argininrester. På grundlag af placeringen af methylgruppetilsætningen kan PRMT’er klassificeres i type I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 og PRMT8) og type II (PRMT5 og PRMT7). PRMT’er af type II har vist sig at være stærkt involveret i sygdomme som kræft.5 PRMT5 spiller f.eks. en rolle i undertrykkelsen af visse tumorsuppressorgener såsom RB-tumorsuppressorer, mens PRMT7-overekspression er observeret i brystkræft. Påvisning af aktivitet og hæmning af type II PRMT’er samt andre HMT’er vil være vigtig for at klarlægge mekanismerne for epigenetisk regulering af genaktivering og -dæmpning samt for kræftdiagnostik og -terapeutik.
Start med at isolere dine histonproteiner fra dine prøver af interesse, og vælg derefter et passende ELISA-kit til at detektere histonmethyleringsniveauer.
Histondemethylering er fjernelse af methylgrupper i modificerede histonproteiner via histondemethylaser. Disse demethylaser har vist sig at have potentielle onkogene funktioner og inddragelse i andre patologiske processer. Opdagelsen af histondemethylaser viser, at histonmethylering ikke er en permanent modifikation, men snarere en mere dynamisk proces. Der er blevet opdaget to store familier af demethylaser: Lysin-specifik demethylase 1 (LSD1) og histondemethylaser med Jumonji-domæne (JmjC-domæne) (JMJD2, JMJD3/UTX og JARIDs). Den specifikke aminosyrerest og graden af methylering bestemmer demethyleringsenzymet. På histon H3 demethyleres f.eks. mono- og di-methyleret lysin 4 af LSD1 (BHC110, KDM1) og tri-methyleret lysin 4 af JARID (1A-1D); di- og trimetyleret lysin 27 demeteres af JMJD3 og UTX (KDM6A) og mono- og di-metyleret lysin 9 demeteres af JMJD1 og trimetyleret lysin 9 demeteres af JMJD2.6 Hæmning af histondemethylaser kan føre til histonremethylering ved specifikke rester, der er vigtige for kromatindynamikken og genekspressionen. Endvidere vil påvisning af disse enzymers aktivitet og hæmning være vigtig for at klarlægge mekanismerne for epigenetisk regulering af genaktivering og -silensning og kan være til gavn for kræftdiagnostik og -terapi.
Udtræk dine kerneproteiner fra din prøve af interesse, og anvend derefter en ELISA-baseret teknik til at undersøge aktivitets- og hæmningsniveauer af histondemethylaser af LSD1- og JmjC-domænefamilierne.
Er du klar til at lære om en anden epigenetisk mekanisme? Læs videre: Ikke-kodende RNA
