Una modificación de las histonas es una modificación postraduccional covalente (PTM) de las proteínas histónicas que incluye la metilación, la fosforilación, la acetilación, la ubiquitilación y la sumoilación. Las PTM realizadas a las histonas pueden afectar a la expresión de los genes alterando la estructura de la cromatina o reclutando modificadores de las histonas. Las proteínas histónicas actúan para empaquetar el ADN, que se envuelve alrededor de las ocho histonas, en los cromosomas. Las modificaciones de las histonas actúan en diversos procesos biológicos, como la activación/inactivación transcripcional, el empaquetamiento de los cromosomas y el daño/reparación del ADN. En la mayoría de las especies, la histona H3 está principalmente acetilada en las lisinas 9, 14, 18, 23 y 56, metilada en la arginina 2 y en las lisinas 4, 9, 27, 36 y 79, y fosforilada en ser10, ser28, Thr3 y Thr11. La histona H4 está principalmente acetilada en las lisinas 5, 8, 12 y 16, metilada en la arginina 3 y la lisina 20, y fosforilada en la serina 1. Así, la detección cuantitativa de varias modificaciones de las histonas proporcionaría información útil para una mejor comprensión de la regulación epigenética de los procesos celulares y el desarrollo de fármacos dirigidos a las enzimas modificadoras de las histonas.
La acetilación/desacetilación de las histonas
La acetilación de las histonas se produce por la adición enzimática de un grupo acetilo (COCH3) procedente de la acetil coenzima A. El proceso de acetilación de las histonas está estrechamente implicado en la regulación de muchos procesos celulares, como la dinámica de la cromatina y la transcripción, el silenciamiento de genes, la progresión del ciclo celular, la apoptosis, la diferenciación, la replicación del ADN, la reparación del ADN, la importación nuclear y la represión neuronal. Las enzimas modificadoras que intervienen en la acetilación de las histonas se denominan histona acetiltransferasas (HAT) y desempeñan un papel fundamental en el control de la acetilación de las histonas H3 y H4. Se han identificado más de 20 HAT que pueden clasificarse en cinco familias: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP y coactivadores de receptores nucleares como ACTR.1 La acetilación de la histona H3 puede aumentar por la inhibición de las histonas desacetilasas (HDAC) y disminuir por la inhibición de las HAT.
Las histonas desacetilasas (HDAC) catalizan la eliminación hidrolítica de los grupos acetilo de los residuos de lisina de las histonas. Un desequilibrio en el equilibrio de la acetilación de las histonas se ha asociado con la tumorigénesis y la progresión del cáncer. Detectar si la histona H3 está acetilada en sus residuos de lisina proporcionaría información útil para una mayor caracterización de los patrones o sitios de acetilación, lo que conduciría a una mejor comprensión de la regulación epigenética de la activación de los genes, así como al desarrollo de fármacos dirigidos a las HAT. Al igual que las HAT, las HDAC desempeñan un papel fundamental en varios procesos celulares en los que intervienen las histonas H3 y H4. Hasta ahora, se han identificado al menos 4 clases de HDACs. Las HDAC de clase I incluyen las 1, 2, 3 y 8. Las HDAC de clase II son las 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Las enzimas de clase III, conocidas como sirtuinas, requieren cofactores NAD+ e incluyen las SIRT 1-7. La enzima de clase IV, que sólo contiene la HDAC11, tiene características tanto de la clase I como de la II. La inhibición de la HDAC tiene efectos significativos sobre la apoptosis, la detención del ciclo celular y la diferenciación en las células cancerosas. Los inhibidores de HDAC se están desarrollando actualmente como agentes anticancerígenos.2
Extraiga las proteínas nucleares de su muestra de interés y, a continuación, utilice un método similar a ELISA para medir la cantidad de proteínas HDAC, o los niveles de actividad de HDAC o los niveles de actividad de HAT.
La metilación/desmetilación de las histonas
La metilación de las histonas se define como la transferencia de uno, dos o tres grupos metilo de la S-adenosil-L-metionina a los residuos de lisina o arginina de las proteínas histónicas por parte de las histonas metiltransferasas (HMT). Las HMT controlan o regulan la metilación del ADN mediante la represión o activación transcripcional dependiente de la cromatina. En el núcleo de la célula, cuando se produce la metilación de la histona, pueden activarse o silenciarse genes específicos dentro del ADN complejado con la histona.3 Existen varias histonas metiltransferasas diferentes que son específicas para el residuo de lisina o arginina que modifican. En la histona H3, por ejemplo, SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx y SMYD3 son histona metiltransferasas que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 4 (H3-K4) en células de mamíferos. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 y Eu-HMTase son histona metiltransferasas que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 9 (H3-K9) en las células de mamíferos. G9a y las enzimas del grupo polycomb, como EZH2, son metiltransferasas de histonas que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 27 (H3-K27) en las células de mamíferos.4 Tanto la metilación de la H3-K9 como la de la H3-K27 median en la formación de la heterocromatina y también participan en el silenciamiento de la expresión génica en los sitios eucromáticos. El aumento de la metilación global de H3-K27 también está implicado en algunos procesos patológicos como la progresión del cáncer.
Por otro lado, la metilación de arginina de las histonas H3 y H4 promueve la activación transcripcional y está mediada por una familia de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs). Existen 9 tipos de PRMTs en los seres humanos, pero sólo 7 miembros son responsables de la metilación de las histonas. Pueden mediar en la mono o dimetilación de los residuos de arginina. En función de la posición de la adición del grupo metilo, las PRMT pueden clasificarse en tipo I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 y PRMT8) y tipo II (PRMT5 y PRMT7). Las PRMT de tipo II están fuertemente implicadas en enfermedades como el cáncer.5 Por ejemplo, la PRMT5 desempeña un papel en la represión de ciertos genes supresores de tumores, como el RB, mientras que la sobreexpresión de la PRMT7 se observa en el cáncer de mama. La detección de la actividad y la inhibición de las PRMT de tipo II, así como de otras HMT, sería importante para dilucidar los mecanismos de regulación epigenética de la activación y el silenciamiento de los genes, así como para beneficiar el diagnóstico y la terapéutica del cáncer.
Empiece por aislar las proteínas histónicas de sus muestras de interés, y luego seleccione un kit ELISA apropiado para detectar los niveles de metilación de las histonas.
La desmetilación de las histonas es la eliminación de los grupos metilo en las proteínas histónicas modificadas a través de las desmetilasas de las histonas. Se ha descubierto que estas desmetilasas tienen potenciales funciones oncogénicas y están implicadas en otros procesos patológicos. El descubrimiento de las desmetilasas de histonas demuestra que la metilación de las histonas no es una modificación permanente, sino un proceso más dinámico. Se han descubierto dos grandes familias de desmetilasas: La desmetilasa específica de lisina 1 (LSD1) y las desmetilasas de histonas que contienen el dominio Jumonji (dominio JmjC) (JMJD2, JMJD3/UTX y JARIDs). El residuo de aminoácido específico y el grado de metilación determinan la enzima de desmetilación. Por ejemplo, en la histona H3, la lisina 4 mono- y di-metilada es desmetilada por LSD1 (BHC110, KDM1) y la lisina 4 tri-metilada por JARID (1A-1D); la lisina 27 di- y tri-metilada es desmetilada por JMJD3 y UTX (KDM6A) y la lisina 9 mono- y di-metilada es desmetilada por JMJD1 y la lisina 9 tri-metilada es desmetilada por JMJD2.6 La inhibición de las desmetilasas de histonas puede conducir a la remetilación de las histonas en residuos específicos importantes para la dinámica de la cromatina y la expresión génica. Además, la detección de la actividad e inhibición de estas enzimas sería importante para dilucidar los mecanismos de regulación epigenética de la activación y el silenciamiento de los genes y podría beneficiar el diagnóstico y la terapéutica del cáncer.
Extraiga las proteínas nucleares de su muestra de interés y, a continuación, despliegue una técnica basada en ELISA para investigar los niveles de actividad e inhibición de las desmetilasas de histonas de las familias LSD1 y JmjC-domain.
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