Representaciones distintas de las cualidades gustativas básicas en la corteza gustativa humana

Sujetos y procedimientos de obtención de imágenes

Experimento 1 (3,0 T): Veinte adultos sanos (11 hombres, de 26,2 ± 3,1 años de edad) dieron su consentimiento informado para participar en el experimento. Los datos de 16 participantes ya se han comunicado en nuestro estudio anterior15. Cuatro participantes fueron reclutados recientemente para este estudio. Los criterios de exclusión incluyen antecedentes psiquiátricos o neurológicos significativos. Este estudio fue aprobado por el Consejo Ético de Investigación (REB) de la Universidad de Toronto y el REB del hospital SickKids. No se realizó ninguna prueba estadística para determinar el tamaño de la muestra a priori. Los tamaños de muestra que elegimos son similares a los utilizados en publicaciones anteriores16, 26. El experimento se realizó utilizando un sistema de RMf de 3,0 T (Siemens Trio). Primero se recogieron imágenes de localización para alinear el campo de visión (FOV) centrado en el cerebro de cada participante. Se obtuvieron imágenes anatómicas ponderadas en T1 (1 mm3, 256 × 256 FOV; secuencia MPRAGE) antes de las ejecuciones experimentales de imágenes ecoplanares (EPI). Para las imágenes funcionales, se utilizó una secuencia ecoplanar de gradiente (tiempo de repetición (TR) = 2000 ms; tiempo de eco (TE) = 27 ms; ángulo de flip = 70°). Cada serie funcional consistió en 263 adquisiciones de todo el cerebro (cortes de 40 × 3,5 mm; adquisición intercalada; FOV = 192 mm; tamaño de la matriz = 64 × 64; resolución en el plano de 3 mm). Las primeras cuatro imágenes funcionales de cada serie se excluyeron del análisis para permitir el equilibrio de la magnetización longitudinal.

Experimento 2 (7,0 T): Once adultos sanos (6 hombres, de 22,2 ± 2,2 años de edad) dieron su consentimiento informado para participar en el experimento. Este estudio fue aprobado por el comité ético del Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas de Japón. No se realizó ninguna prueba estadística para determinar el tamaño de la muestra a priori. Los tamaños de muestra que elegimos son similares a los utilizados en publicaciones anteriores16, 26. El experimento se llevó a cabo utilizando un sistema de RMf de 7,0 T (Siemens Magnetom). Primero se recogieron imágenes de localización para alinear el FOV centrado en el cerebro de cada participante. Se obtuvieron imágenes anatómicas ponderadas en T1 (0,75 mm isométrico, 224 × 300 FOV; secuencia MPRAGE). Para las imágenes funcionales, se utilizó una secuencia ecoplanar de gradiente (TR = 500 ms; TE = 25 ms; ángulo de flip = 35°; factor multibanda = 4). Cada serie funcional consistió en 1010 adquisiciones de todo el cerebro (32 × 2,0 mm cortes; adquisición intercalada; FOV = 208 mm; tamaño de la matriz = 104 × 104; resolución en el plano de 2 mm). Las primeras cuatro imágenes funcionales de cada serie se excluyeron del análisis para permitir el equilibrio de la magnetización longitudinal.

Procedimientos conductuales

Experimento 1: Los estímulos gustativos se administraron mediante tubos de plástico que convergían en un colector de plástico, cuya boquilla goteaba soluciones gustativas en la boca. Los tubos se prellenaron de forma que no se observara casi ningún retraso entre la presentación del estímulo visual y la entrega del líquido. Se realizaron cien ensayos con soluciones gustativas de forma aleatoria y equilibrada en cinco series. En cada ensayo, se administraron 0,5 mL de solución gustativa durante 1244 ms. Cuando el suministro de líquido finalizaba, una pantalla indicaba a los participantes que debían tragar el líquido (1 s). Después de 7756 ms, aparecieron barras de escala para calificar la positividad (3 s) y luego la negatividad (3 s) del líquido. A continuación, se administraron 0,5 mL del líquido insípido durante 1244 ms para el enjuague, seguido de la instrucción de tragar durante 1 s. Después de un intervalo entre ensayos de 7756 ms, comenzaba el siguiente ensayo.

Experimento 2: En comparación con el Experimento 1, la entrega de estímulos gustativos difería sólo en su tiempo y cantidad. Se realizaron cien ensayos de solución gustativa de forma aleatoria y equilibrada en cinco series. En cada ensayo, se suministraron 0,88 mL de solución gustativa a lo largo de 2 s. Al finalizar el suministro de líquido, una pantalla indicaba a los participantes que debían tragarlo (2 s). Después de 4.000 ms, aparecieron barras de escala para calificar la positividad (3 s) y luego la negatividad (3 s) del líquido. A continuación, se suministraron 0,88 mL del líquido insípido durante 2 s para el enjuague, seguido de la instrucción de tragar durante 2 s. Después de un intervalo de 7 s entre ensayos, comenzó el siguiente ensayo.

Sesión preexperimental

Experimento 1: Para tener en cuenta las diferencias individuales en sus experiencias subjetivas de los diferentes sabores, se pidió a los participantes que probaran una gama más amplia de intensidades (medidas por concentraciones molares) de las diferentes soluciones gustativas (ácido, salado, amargo y dulce). En esta sesión preexperimental, los participantes realizaron 1 prueba (2 mL) de cada una de las 16 soluciones gustativas de la siguiente manera (1) ácido agrio/ácido cítrico: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M y 1,0 × 10-2 M; (2) salado/sal común: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M y 1,0 × 10-1 M; (3) amargo/sulfato de quina: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M y 7,8 × 10-6 M; y (4) dulce/sacarosa: 1,0 M, 0,56 M, 0,32 M y 0,18 M. El orden de presentación fue aleatorio por sabor y luego por concentración dentro de cada sabor. Después de beber cada solución, los participantes se enjuagaron y tragaron 5 mL de agua, y luego calificaron la intensidad y el placer (valencia) de la experiencia de la solución en escalas separadas de 1 a 9. Se seleccionaron las concentraciones de cada sabor que coincidían en intensidad. En trabajos anteriores2 se había demostrado que los participantes tienen diferentes bases de puntuación y que las concentraciones seleccionadas con mayor fiabilidad están por encima de la intensidad media autodeclarada. Todas las soluciones se mezclaron utilizando compuestos químicos de grado farmacéutico de Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), seguros para el consumo.

Experimento 2: Los participantes fueron sometidos a una prueba (1 mL) de cada una de las 16 soluciones gustativas de la siguiente manera: (1) dulce 1/glucosa: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M y 0,38 M; (2) dulce 2/sucralosa: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M y 0,26 × 10-4 M; (3) amargo 1/catequina: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M y 4,4 × 10-3 M; y (4) amargo 2/cloruro de magnesio: 0,4 M, 0,2 M, 0,1 M y 0,05 M. El orden de presentación fue aleatorio por sabor y luego por concentración dentro de cada sabor. Después de beber cada solución, los participantes se enjuagaron y tragaron 5 mL de agua, y luego calificaron la intensidad y el placer (valencia) de la experiencia de la solución en escalas separadas de 1 a 9. Se seleccionaron las concentraciones de cada sabor que coincidían en intensidad. Todas las soluciones se mezclaron utilizando compuestos químicos de calidad alimentaria de DHC (catequina), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (cloruro de magnesio), Tsuruya Chemical Industries (sucralosa) y Nichiga (glucosa).

Análisis de datos

Los datos se analizaron utilizando el software SPM8 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Las imágenes funcionales se realinearon, se corrigió la sincronización de los cortes y se normalizaron a la plantilla MNI (ICBM 152) con interpolación a un espacio de 2 × 2 × 2 mm. Los datos se suavizaron espacialmente (ancho completo, medio máximo (FWHM) = 6 mm) para el análisis de la modulación paramétrica univariante, pero no para el análisis del patrón multivoxel, ya que puede perjudicar el rendimiento19. Cada presentación de estímulo se modeló como un evento separado, utilizando la función canónica en SPM8. Para cada vóxel, los valores t de los ensayos individuales se redujeron restando el valor medio de los ensayos. Para visualizar los resultados de las imágenes, se utilizó el software freesurfer39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) y la caja de herramientas SPM surfrend (escrita por I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) tras su modificación.

Análisis univariante

Llevamos a cabo análisis univariantes para examinar si los sabores básicos eran codificados por vóxeles específicos en la ínsula. Los regresores que codifican cada sabor están ligados a la presentación del estímulo. Los análisis univariantes se realizaron dos veces: con y sin regresores de valencia hedónica (Fig. 1). Para visualizar cuánta varianza podía ser explicada por los regresores de valencia hedónica en las regiones sensibles a lo amargo, seleccionamos los vóxeles significativos en el contraste «amargo vs. insípido» sin regresión de valencia (Figura Suplementaria 1). La actividad promedio se mostró para la actividad contra la línea de base en reposo (Figura Suplementaria 1a), la actividad contra lo insípido (Figura Suplementaria 1b), y la actividad contra lo insípido con la regresión de la valencia (Figura Suplementaria 1c). Para comprobar la existencia de una sintonía gustativa específica de los vóxeles, dividimos los recorridos pares e impares de cada participante, comparando la actividad de los vóxeles para cada sabor en los recorridos impares con la actividad de los vóxeles para cada sabor en los recorridos pares. A modo de ilustración, cuando los vóxeles se ordenaron según la activación de cada sabor en los recorridos pares, encontramos patrones consistentes de activación decreciente para los cuatro sabores en los recorridos impares (Fig. 1b, Figura Suplementaria 4). Se calcularon las correlaciones para la activación de los vóxeles entre los recorridos pares e impares entre todas las combinaciones de sabores dentro de cada participante, sometidas a una prueba t de una muestra entre los participantes (Fig. 1c, Fig. 4a, b). Además, calculamos las correlaciones entre los recorridos pares e impares para todas las combinaciones de sabores iguales y diferentes dentro de cada participante. Los coeficientes de correlación se transformaron en z y se sometieron a una prueba t de una muestra entre los participantes (Fig. 1d, Fig. 4b, d).

Análisis de reflectores para las representaciones de tipo de sabor

Analizamos los datos de fMRI de la corteza insular utilizando el análisis de reflectores (radio de 4 mm, incluyendo 33 voxels)20. Dentro de una esfera determinada para cada participante, se creó un vector que contenía el patrón espacial de la señal BOLD-MRI vinculado al tiempo de presentación del estímulo (valores t normalizados por vóxel). Para evaluar si los patrones de actividad en las esferas de los focos son capaces de discriminar los tipos de sabor, empleamos una validación cruzada de dejar un par de estímulos fuera40. En este procedimiento, el clasificador LDA se entrenó en 38 ensayos, que incluían el tipo de sabor probado y otro tipo de sabor (19 ensayos para cada uno) y luego se probó en el par de estímulos que se dejó fuera. El rendimiento de la clasificación para cada sabor se promedió a través de las comparaciones con otros sabores (por ejemplo, el rendimiento de la clasificación de ácido se promedió a través de ácido frente a dulce, ácido frente a amargo, ácido frente a salado y ácido frente a insípido). A nivel de individuos, el 58,7% de precisión en la clasificación correspondió a p < 0,05 sin corregir. Para el análisis de grupos, los mapas de rendimiento de la clasificación individual se suavizaron con un núcleo gaussiano de 4 mm FWHM y luego se sometieron a una prueba de permutación de una muestra utilizando SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). En este procedimiento, los datos de cada participante se invirtieron aleatoriamente multiplicando – 1 después de restar el 50% (nivel de precisión del azar) y luego se sometieron a una prueba t de una muestra entre los participantes. Esto se permutó 10.000 veces, dando como resultado la distribución de t máxima dentro de la ínsula. Sobre la base de esta distribución, se determinó el umbral del 5% de FWE.

Análisis de conjunción de sabores

Para el análisis de conjunción de múltiples sabores (Fig. 2b), se comprobó si cada vóxel superaba el umbral para las cuatro discriminaciones de tipo de sabor donde cada discriminación de tipo de sabor promediaba el rendimiento de la clasificación a través de cuatro comparaciones (por ejemplo, agrio frente a dulce, agrio frente a amargo, agrio frente a salado y agrio frente a insípido), superando la clasificación de azar (50%). La inferencia de conjunción válida requiere resultados significativos para todas las comparaciones41. Por lo tanto, contamos el número de tipos de sabor que satisfacen el umbral del 5% de FWE en cada vóxel dentro de la ínsula.

Análisis de pares de sabor

Para el análisis de pares de sabor específicos, examinamos una ROI definida independientemente dentro de la ínsula. En primer lugar, utilizamos un procedimiento de exclusión de un solo sujeto, excluyendo a cada uno de los 20 sujetos, y luego calculando un mapa de conjunción de 4 sabores (es decir, vóxeles que satisfacen los 4 contrastes de sabor descritos anteriormente) con los 19 sujetos restantes, lo que resulta en 20 mapas. La superposición de estos 20 mapas de grupo se muestra en la Fig. 2c. Los vóxeles del mapa que satisfacen el umbral del 5% de FWE se definieron como la ROI capaz de discriminar el sabor. Dentro de este ROI, examinamos la discriminación de pares de sabores específicos, calculando el rendimiento de la clasificación de cada par de sabores. El rendimiento del grupo se calculó como el rendimiento de clasificación medio de 20 sujetos (Fig. 2d).

Para la discriminación de pares de sabores basada en las valoraciones de la valencia (Fig. 2e), realizamos un análisis LDA utilizando las valoraciones de la valencia de los sujetos (es decir, independiente de los datos de fMRI). La valencia se calculó restando la valoración de negatividad de la valoración de positividad para cada ensayo. La clasificación del sabor se calculó utilizando una exclusión de un solo ensayo entrenada en los 19 ensayos restantes para cada tipo de sabor.

Análisis de la valencia y del tipo de sabor

Para probar la independencia del tipo de sabor de la valencia, examinamos la similitud de los datos de fMRI dentro de la ROI definida por el mapa de conjunción de cuatro sabores anterior. Para cada sujeto, se calcularon las correlaciones ensayo por ensayo, lo que dio como resultado 4950 (100 × 99/2) coeficientes de correlación, clasificados en 2 × 2 categorías de tipo de sabor (igual, diferente) × valencia hedónica (igual, diferente). Los coeficientes de correlación se promediaron dentro de cada celda por sujeto y, a continuación, los datos de todos los sujetos se sometieron a un ANOVA de dos medidas repetidas con el tipo de sabor y la valencia como factores (Fig. 2g).

Además, realizamos un análisis de seguimiento sin dependencia de los datos en las correlaciones ensayo a ensayo a través de las celdas de 2 × 2. Poblamos aleatoriamente cada celda con los 100 ensayos, repitiendo este procedimiento 1.000.000 de veces. A partir de ellas, analizamos la permutación con la mayor congruencia entre los factores 2 × 2 y las categorías de ensayos reales (basada en la media geométrica máxima de la proporción de los datos reducidos en las cuatro celdas). A continuación, calculamos las correlaciones entre ensayos sólo dentro de cada celda, asegurando que no hubiera dependencia entre celdas. Los coeficientes de correlación se promediaron dentro de cada celda por sujeto y, a continuación, los datos de todos los sujetos restantes se sometieron a un ANOVA de dos medidas repetidas (Figura Suplementaria 3).

Los patrones de tipo de sabor diferían independientemente de la valencia del sabor, es decir, los mapas de discriminación del sabor eran disociables de la palatabilidad. Debido a la fuerte asociación entre el tipo de sabor y la valencia, las combinaciones de ensayos no eran iguales en todos los niveles. Por ejemplo, la misma valencia con diferentes tipos de sabor fue relativamente rara (Tabla Suplementaria 4). Sin embargo, esto no indica multicolinealidad en el tamaño del efecto.

Estadística

Analizamos los datos sin asumir una distribución normal, utilizando estadísticas no paramétricas. Antes del ANOVA (Fig. 2g), se realizó la prueba de Levene para asegurar que se cumplía el supuesto de homocedasticidad. Se aplicaron correcciones de comparaciones múltiples, utilizando la corrección de Bonferroni.

Resumen del informe

Puede obtenerse más información sobre el diseño experimental en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.