Heparin-Induced Thrombocytopenia (HIT) – A sensible laboratory approach (hopefully)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Posted: January 28, 2020

Heparin-Induced Thrombocytopenia (HIT) – A sensible laboratory approach (hopefully)

W 1980 roku zostałem narażony na moją pierwszą prośbę o zbadanie zaburzenia, którego nigdy nie doświadczyłem. Hematolog z naszej instytucji przyszedł z prośbą o sprawdzenie, czy pacjent w naszej instytucji może mieć przypadek trombocytopenii indukowanej heparyną (HIT). Nigdy wtedy nie słyszałem o tym zaburzeniu, więc musiałem sięgnąć do starego sposobu szukania go w Index Medicus (rzeczywistych książkach) w poszukiwaniu odniesienia. Nie mogłem znaleźć żadnych procedur laboratoryjnych w tym czasie w naszej okolicy, więc wyruszyłem na misję, aby uzyskać metodę zatwierdzoną, abym mógł pomóc temu lekarzowi w leczeniu tego tematu. Później znalazłem metodę wykorzystującą agregometrię transmitancji światła (LTA). W tej procedurze wykorzystano osocze bogatopłytkowe normalnego dawcy (PRP) i surowicę dawcy pacjenta z wieloma stężeniami UFH w celu sprawdzenia reakcji agregacji. Zostało to przeprowadzone na dwukanałowym agregometrze LTA Chronolog. Nie mogę dać tobie odniesienia ponieważ Pubmed tylko idzie z powrotem do 1983 na temacie.

Ten musiałem nauczyć się co HIT był o. HIT jest następstwem odpowiedzi immunologicznej, która jest sprzecznością w terminach albo „paradoksem” reakcji. Małopłytkowość immunologiczna indukowana lekami może być spowodowana przez leki takie jak chinina i wankomycyna, które powodują natychmiastową i drastyczną małopłytkowość (<20 x 109/L), co powoduje poważne krwawienie. Osoba z prawdziwą reakcją HIT może stracić 50% swoich płytek krwi po rozpoczęciu stosowania heparyny po okresie 5 dni lub dłuższym, ale zamiast problemów krwotocznych rozwijają się problemy zakrzepowe.

HIT jest problemem związanym z reakcją immunologiczną spowodowaną przez przeciwciała IgG. Przeciwciała te rozwijają się w odpowiedzi na heparynę niefrakcjonowaną (UFH) i heparynę drobnocząsteczkową (LMWH). Częstość występowania w odpowiedzi na terapię UFH wynosi 0,5-5%. W terapii LMWH częstość występowania HIT jest jedną dziesiątą częstości obserwowanej przy stosowaniu UFH.

HIT jest zaburzeniem, które wymaga od lekarza podejmowania szybkich decyzji w celu zapobieżenia katastrofalnym następstwom dla pacjenta. Mogą oni używać wyniku 4Ts wraz z liczbą płytek krwi, aby kierować się tym, czy zamówić protokoły badań laboratoryjnych: 4Ts jest systemem punktacji przedtestowej dla HIT, który jest szeroko stosowany w praktyce klinicznej. Patrz tabela poniżej. Tytuł odnosi się do czterech cech HIT:

• Thrombocytopenia
• Timing of thrombocytopenia relative to heparin exposure
• Thrombosis or other sequelae of HIT
• Likelihood of other causes of thrombocytopenia

Table. 4Ts score

.

Feature	Score
	2 punkty	1 punkt	1 punkt	0 punktów
Thrombocytopenia	>50% spadek i nadir płytek 20-.100 × 109/L	30%-50% spadek lub nadir płytek 10-19×109/L	< 30% spadek lub nadir płytek krwi < 10×109/L
Timing of platelet count fall	Clear onset on day 5-10, lub ≤1 dzień, jeśli ekspozycja na heparynę miała miejsce w ciągu ostatnich 30 dni	Zgodny ze spadkiem w dniach 5-10, ale niejasny (np. brak danych dotyczących liczby płytek krwi); początek po 10. dniu; lub spadek o ≤1 dzień, jeśli ekspozycja na heparynę miała miejsce 30-100 dni temu	Zmniejszenie liczby płytek krwi o ≤4 dni bez niedawnej ekspozycji na heparynę
Zakrzepica lub inne następstwa	Nowa zakrzepica (potwierdzona); martwica skóry w miejscach wstrzyknięcia heparyny; reakcja anafilaktoidalna po podaniu dożylnym bolusa heparyny; krwotok do nadnerczy	Postępująca lub nawracająca zakrzepica; rumieniowe zmiany skórne; podejrzenie zakrzepicy, ale nie udowodnione	Brak
Inne przyczyny trombocytopenii	Bez widocznych	Możliwe	Nieokreślone

Maksymalny wynik to 8. Wynik 6-8 wskazuje na wysokie prawdopodobieństwo wystąpienia HIT. Wynik 4-5 wskazuje na pośrednią obecność HIT, a wynik 0-3 oznacza niską możliwość obecności HIT.3,4

Jeśli HIT jest podejrzewany przez podwyższony wynik 4Ts, laboratorium pomoże lekarzowi w postawieniu dokładnej diagnozy. Można to osiągnąć za pomocą wielu testów. Zazwyczaj dzielą się one na dwie klasy: immunologiczne i funkcjonalne. Poniższe informacje omówią testy, które są najczęściej stosowane w badaniach laboratoryjnych dla tego zaburzenia.

Laboratoryjne badania diagnostyczne dla HIT

HIT Immunoassay: Testy wykrywające przeciwciała anty-PF4/heparyna

Amunoenzymatyczne testy immunologiczne (EIA) (wykrywają IgG)

EIA (wykrywają przeciwciała wieloswoiste)

Metody te są zwykle zależne od PF4 i charakteryzują się wysoką czułością. Podmioty z HIT będą miały 97% pozytywnych testów z zestawami fazy stałej. Są one szeroko dostępne komercyjnie. Metody te są zwykle testowane partiami z powodu czasu trwania tej metody. Jednakże, słabo pozytywne wyniki mogą mieć niską specyficzność. Wytyczne dotyczące wyników dodatnich powinny być ustalane w każdym laboratorium.

– IgG-specyficzny test chemiluminescencyjny (CLIA)

– Chemiluminescencyjny test immunologiczny (CLIA) jest szybką zautomatyzowaną procedurą, która wykrywa przeciwciała przeciwko PF4/heparynie przy użyciu cząstek magnetycznych pokrytych PF4/poliwinylosulfonianem (PVS). Po inkubacji, separacji magnetycznej i etapie płukania, dodawany jest znacznik składający się z przeciwciała przeciwludzkiego IgG znakowanego izoluminolem, które wiąże się z przeciwciałami anty-PF4/heparyna na cząstkach. Druga inkubacja, separacja magnetyczna i płukanie kończą reakcję. Otrzymuje się odczyt OD proporcjonalny do stężenia mierzonych przeciwciał anty-PF4/heparyna. Testy są zwykle wykonywane na żądanie, a czas ich wykonania wynosi około 30 minut. W badaniu porównującym tę metodę ze złotym standardem, jakim jest test uwalniania serotoniny (SRA), korelacje testów były znakomite pod względem swoistości i czułości (odpowiednio 98,8/97,0%).6

– Latex immunoturbidometric assay (LIA) for (HIT).

LIA jest klasyfikowana jako test immunologiczny. Różni się on od większości innych testów immunologicznych, takich jak EIA, tym, że obecność przeciwciał reagujących na PF4/heparynę w osoczu pacjenta powoduje zahamowanie aglutynacji cząsteczek poprzez konkurencję z przeciwciałem monoklonalnym naśladującym HIT. Zgodnie z tym, LIA została nazwana „funkcjonalizowanym testem immunologicznym”, co teoretycznie sugeruje, że może ona zapewnić swoistość diagnostyczną pośrednią pomiędzy wysoce swoistym testem funkcjonalnym, SRA, a mniej swoistymi, zależnymi od PF4 metodami EIA. Jest to łatwa do zautomatyzowania procedura, której czas wykonania wynosi około 20 minut. Badania wykazały czułość 97,4% i swoistość 91,2%.7

Test przepływu bocznego (STiC):

Testy immunologiczne przepływu bocznego wykrywają przeciwciała IgG przeciwko kompleksom PF4/polianionów zawartych w karcie oceny, w której wyniki są odczytywane wizualnie. Przy 10-minutowym czasie inkubacji jest to szybka metoda określania obecności HIT.

Funkcjonalne testy HIT: Testy, które wykrywają przeciwciała zdolne do wiązania i aktywacji płytek krwi

Test uwalniania serotoniny (SRA) – Test aktywacji płytek krwi indukowany heparyną (HIPA) – Test agregacji płytek krwi (PAT) – Testy oparte na cytometrii przepływowej.

Test uwalniania serotoniny (SRA): test potwierdzający HIT

Ta metoda wykrywa przeciwciała aktywujące płytki krwi. SRA mierzy radiolabelowaną serotoninę uwalnianą z płytek krwi.9,10 Wynik dodatni wymaga > 20% uwalniania serotoniny przy niskiej dawce UFH i < 20% uwalniania w obecności wysokich poziomów UFH. Metoda ta w przeszłości była powszechnie uznawana za złoty standard dla badań potwierdzających. Charakteryzuje się ona 95% czułością i swoistością. SRA wychwytuje wykrycie przeciwciał aktywujących płytki krwi. Ma najwyższą czułość/specyficzność dla klinicznego HIT. SRA ma również znacznie większą swoistość diagnostyczną niż EIA. SRA nie powinien być wykonywany bez wcześniejszego pozytywnego wyniku EIA jako test przesiewowy. Pomoże to wykluczyć kwestię fałszywie dodatniego wyniku SRA. Jeśli ujemny wynik EIA zostanie znaleziony w badanej próbce z dodatnim SRA, powinno to być „ostrzeżeniem czerwonej flagi”, że metoda SRA musi zostać oceniona.

SRA może również dostarczyć informacji na temat tego, czy próbka surowicy HIT może wytworzyć silną odpowiedź płytkową przy braku heparyny. Aktywacja płytek krwi niezależna od heparyny jest ostrzeżeniem o wyjątkowo ciężkiej obecności HIT. To odkrycie może wskazywać na HIT o opóźnionym początku i silnie pozytywny HIT z obecnością koagulopatii konsumpcyjnej z ryzykiem zakrzepicy mikronaczyniowej.

Test jest złożony, drogi i czasochłonny. Wymagane są prawidłowe płytki krwi dawcy (trudne do standaryzacji z powodu indywidualnych reakcji normalnych dawców). Dlatego też jest to stosunkowo niestandaryzowany test, który nie jest szeroko stosowany.9,10

Test aktywacji płytek indukowanej heparyną (HIPA):

Ta metoda jest testem aktywacji płytek mytych, który jest zwykle wykonywany tylko w Europie. Ten test jest wykonywany przez agregację płytek krwi i określany wizualnie przez punkt końcowy aktywacji płytek krwi.10 Dla porównania, SRA jest wykonywany przez badanie płytek krwi we wstrząsarce i reaguje przez 60 minut. HIPA różni się tym, że wykorzystuje mieszane płytki krwi i jest odczytywana wizualnie w odstępach 5-minutowych przez 45 minut.

Niektórzy badacze zaobserwowali, że metoda HIPA jest bardziej czuła w wykrywaniu przeciwciał aktywujących płytki krwi niż procedura SRA. To odkrycie może jednak wychwytywać przeciwciała niepatogenne, co prowadzi do obniżenia swoistości diagnozy.6

Platelet Aggregation Assays

(LTA: light transmittance aggregometry)/WB: whole blood aggregometry):

Agregometria LTA (light-transmittance aggregometry) była pierwszym badaniem stosowanym do określenia jakościowej odpowiedzi płytek krwi na przeciwciała HIT. Wykonuje się ją poprzez umieszczenie normalnego PRP dawcy i PRP pacjenta w kuwecie, która jest mieszana. Do mieszaniny dodawana jest heparyna w różnych stężeniach, a agregacja jest monitorowana przez 15 minut. Jeśli próbka wykazuje agregację, dodawane jest wyższe stężenie heparyny, aby określić punkt, w którym agregacja zostaje zahamowana. Otrzymuje się pozytywny lub negatywny wynik jakościowy: negatywny, słabo pozytywny lub silnie pozytywny (0, 2, 3). Ten test nie jest już stosowany ze względu na pracochłonność i stosunkowo niską czułość.11

– Agregometria płytek krwi pełnej (WB) wykorzystuje mieszaninę normalnych płytek krwi dawcy i krwi pełnej pacjenta lub surowicy, w zależności od używanego agregometru. Jeśli ta informacja nie jest znana, dawca powinien mieć grupę krwi O. Dawca (dawcy) krwi pełnej powinien być wstępnie zakwalifikowany (przy użyciu próbki HIT dodatniej), aby zapewnić, że próbka reaguje na przeciwciało. W zależności od metody WB, próbka może być pobrana do zwykłej probówki z 3,2% cytrynianem sodu lub do specjalnej probówki do pobierania hirudyny. Obie metody wykorzystują formę agregometrii impedancyjnej. Dla każdej z metod, heparyna i próbki krwi są inkubowane, a agregacja jest obserwowana za pomocą agregometrii impedancyjnej. Wszystkie próbki wykazujące reakcję agregacji są następnie poddawane próbie z wyższym stężeniem heparyny, aż do momentu, gdy nie dojdzie do stwierdzenia agregacji. Agregometrię płytkową WB uważa się za badanie ilościowe i podaje się wartości z przedziału 0-3, w zależności od stężenia heparyny wymaganego do zmniejszenia obserwowanej agregacji.11

Cytometria przepływowa na obecność HIT

Płytkowy test ekspresji selektyny P (PEA) jest stosowany do oceny HIT za pomocą cytometrii przepływowej. Jak omawialiśmy wcześniej, metoda SRA jest „złotym standardem” dla badań potwierdzających w celu rozpoznania przeciwciał, które mogą rozpoznać PF4 w kompeksie z obecnością heparyny. Niektórzy pacjenci leczeni heparyną bez obecności HIT mogą mieć pozytywny wynik na obecność przeciwciał. SRA jest zwykle dostępna tylko w specjalnych laboratoriach referencyjnych. Metoda ta jest czasochłonna, wymagająca technicznie i ekspansywna. Szybki czas wykonania badania nie jest możliwy, co dodatkowo opóźnia diagnozę w przypadku obecności HIT, który wymaga natychmiastowego leczenia, aby zapobiec ewentualnemu zagrożeniu życia. W ostatnim badaniu oceniono metodę SRA w stosunku do techniki PEA, która wykorzystuje system cytometrii przepływowej. W badaniach wykorzystano test ekspresji P-selektyny PF4 zależnej od PEA. Badanie retrospektywne zostało przeprowadzone na przechowywanych próbkach surowicy od 91 uczestników. Wszyscy badani pacjenci mieli wcześniejsze informacje o HIT 4Ts, które obejmowały: małopłytkowość, czas utraty ilości płytek, diagnozę zakrzepicy i wszelkie inne przyczyny małopłytkowości. Wszystkie osoby z pośrednim wynikiem 4Ts i podwyższonym testem PF4 EIA z OD ≥2,0 lub podwyższonym wynikiem 4Ts i niższym testem PF4 EIA z OK ≥1,0 zostały sklasyfikowane jako HIT dodatnie; pozostałe próbki zostały sklasyfikowane jako HIT ujemne.

W tym badaniu PEA miała wyższy wynik diagnostyczny (obszar pod krzywą 0,92 vs 0,82;P-0,02) niż SRA. Jedenaście z 16 próbek surowicy, które były pozytywne pod względem PEA i negatywne pod względem SRA, było pozytywnych pod względem HIT. Autorzy stwierdzili, że inne badania z użyciem próbek o podobnych markerach płytkowych i próbek seryjnie rozcieńczanych od osób z potwierdzoną diagnozą HIT wykazały, że PEA jest bardziej czuła niż SRA w wykrywaniu przeciwciał aktywujących płytki.

W związku z tym stwierdzili, że PEA jest prostsza do wykonania, a wyniki wykazały większą dokładność przy diagnozowaniu obecności HIT.13

Innym testem opartym na cytometrii przepływowej jest HITAlert firmy IQ Products. W badaniu z 2013 r. opracowano protokół wykorzystujący metodę cytometrii przepływowej HITAlert do wykrywania HIT w warunkach laboratoryjnych szpitala III stopnia. Porównali oni wynik 4Ts w celu przesiewowego wykrycia możliwej obecności HIT u 37 osób. Surowica była analizowana pod kątem obecności przeciwciał HIT metodą cytometrii przepływowej HITAlert, a następnie porównywana z testem antygenowym. Metodami porównawczymi były: metoda immunoenzymatyczna w żelu cząsteczkowym (PaGIA) ID PF4/Hep Ab assay oraz dwa testy funkcjonalne. Zastosowano metodę Multiplate WBA (niedostępną w USA i Kanadzie) oraz SRA. Ich wyniki były następujące: Cytometria przepływowa wykazała pozytywny wynik HIT u 14 z 37 pacjentów. W badaniu 4Ts wynik był niski (0 z 8), pośredni (5 z 19) i wysoki (9 z 10). W porównaniu z SRA metoda przepływowa charakteryzowała się swoistością 100% i czułością 81% w rozpoznawaniu obecności HIT. Test funkcjonalny WBIA również charakteryzował się czułością 81% i swoistością 90% w porównaniu z analizą cytometrii przepływowej. Natomiast procedura PaGIA miała tylko 20% swoistość i 20% czułość. Cytometria przepływowa miała lepszą swoistość w stosunku do procedury antygenowej. Było to najbardziej widoczne w grupie pośredniego ryzyka 4T. Było to widoczne we wszystkich 3 metodach funkcjonalnych zastosowanych w protokole. Badacze doszli do wniosku, że metoda cytometrii przepływowej HITAlert może poprawić swoistość identyfikacji HIT bez utraty czułości.12 To badanie jest przeznaczone wyłącznie do użytku badawczego w USA i Kanadzie i nie jest dostępne dla procedur diagnostycznych.

Podsumowanie dla wykrywania HIT

Chciałbym zakończyć algorytmem, który znajduje się w referencji #14 autorstwa Cukera i wsp. który jest zalecany do diagnozowania HIT. Jest to algorytm diagnostyczny z pośrednim/wysokim wynikiem 4Ts, a następnie testem immunologicznym, a następnie testem funkcjonalnym, który skutkuje: – niewiele wyników fałszywie ujemnych (nietrafione rozpoznania HIT), oraz – niewiele lub brak wyników fałszywie dodatnich (nieprawidłowe rozpoznania HIT).

Uwaga: Badanie czynnościowe może nie być konieczne w przypadku pacjentów z grupy wysokiego prawdopodobieństwa na podstawie ich wyniku 4Ts i bardzo silnie dodatniego wyniku testu immunologicznego (wartość ELISA > 2.0 jednostek OD).

Występowanie HIT jest niepożądaną interakcją lekową moderowaną przez przeciwciała aktywujące płytki krwi, które celują w kompleksy PF4/heparyna. Odpowiedzialnością laboratorium jest określenie właściwych testów laboratoryjnych w celu zidentyfikowania obecności lub zdolności funkcjonalnej przeciwciał aktywujących płytki krwi, indukowanych heparyną. Oznaczenia te muszą być wykonywane w odpowiednim czasie, aby pomóc lekarzom w zapobieganiu katastrofalnym sytuacjom zakrzepowym.

1. Prince M, Wenham T. Heparin-induced thrombocytopenia. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Unfractionated heparin versus low molecular weight heparins for avoiding heparin-induced thrombocytopenia in postoperative patients. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Review. Aktualizacja w: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. Predictive value of the 4Ts scoring system for heparin-induced thrombocytopenia: a systematic review and meta-analysis. . 2012 Nov 15. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Evaluation of pretest clinical score (4 T’s) for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia in two clinical settings. . 2006 Apr. 4(4):759-65.
5. Warkentin TE, Sheppard JI, Moore JC, et al: Quantitative interpretation of optical density measurements using PF4-dependent enzyme immunoassays. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. Warkentin TE. Laboratory diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia. Int. J Lab Hematol. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. Improving clinical interpretation of the anti-platelet factor 4/heparin enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia through the use of receiver operating characteristic analysis, stratum-specific likelihood ratios, and Bayes theorem Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Laboratory testing protocols for heparin-inducd thrombocytopenia (HIT) testing. Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparin-Induced Thrombocytopenia, 5th ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. The platelet serotonin release assay. Am J Hematol… 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT or miss? A comprehensive contemporary investigation of laboratory tests for heparin induced thrombocytopenia. Pathology. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Using HitAlert flow cytometry to detect heparin-induced thrombocytopenia antibodies in a tertiary care hospital…. Blood Coagul and Fibrinolysis. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. A Novel PF4-Dependent Platelet Activation Assay Identifies Patients Likely to have Heparin-Induced Thrombocytopenia/Thrombosis. Chest. 2016 Sep;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).

.