Una modifica degli istoni è una modifica covalente post-traslazionale (PTM) alle proteine istone che include metilazione, fosforilazione, acetilazione, ubiquitylation e sumoilazione. Le PTM apportate agli istoni possono avere un impatto sull’espressione genica alterando la struttura della cromatina o reclutando i modificatori degli istoni. Le proteine istone agiscono per impacchettare il DNA, che si avvolge intorno agli otto istoni, nei cromosomi. Le modifiche degli istoni agiscono in diversi processi biologici come l’attivazione/inattivazione trascrizionale, l’impacchettamento dei cromosomi e il danno/riparazione del DNA. Nella maggior parte delle specie, l’istone H3 è principalmente acetilato alle lisine 9, 14, 18, 23 e 56, metilato all’arginina 2 e alle lisine 4, 9, 27, 36 e 79, e fosforilato a ser10, ser28, Thr3 e Thr11. L’istone H4 è principalmente acetilato alle lisine 5, 8, 12 e 16, metilato all’arginina 3 e alla lisina 20, e fosforilato alla serina 1. Pertanto, la rilevazione quantitativa delle varie modifiche dell’istone fornirebbe informazioni utili per una migliore comprensione della regolazione epigenetica dei processi cellulari e lo sviluppo di farmaci mirati all’enzima modificatore dell’istone.
Acetilazione/Deacetilazione dell’istone
L’acetilazione dell’istone avviene per aggiunta enzimatica di un gruppo acetile (COCH3) dal coenzima acetile A. Il processo di acetilazione degli istoni è strettamente coinvolto nella regolazione di molti processi cellulari tra cui la dinamica della cromatina e la trascrizione, il silenziamento genico, la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi, il differenziamento, la replicazione del DNA, la riparazione del DNA, l’importazione nucleare e la repressione neuronale. Gli enzimi modificatori coinvolti nell’acetilazione degli istoni sono chiamati acetiltransferasi (HATs) e giocano un ruolo critico nel controllo dell’acetilazione degli istoni H3 e H4. Sono state identificate più di 20 HATs che possono essere classificate in cinque famiglie: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP, e coattivatori di recettori nucleari come ACTR.1 L’acetilazione dell’istone H3 può essere aumentata dall’inibizione delle deacetilasi dell’istone (HDACs) e diminuita dall’inibizione delle HAT.
Le deacetilasi dell’istone (HDACs) catalizzano la rimozione idrolitica dei gruppi acetili dai residui di lisina dell’istone. Uno squilibrio nell’equilibrio dell’acetilazione degli istoni è stato associato alla tumorigenesi e alla progressione del cancro. Rilevare se l’istone H3 è acetilato nei suoi residui di lisina fornirebbe informazioni utili per un’ulteriore caratterizzazione dei modelli o dei siti di acetilazione, portando così a una migliore comprensione della regolazione epigenetica dell’attivazione genica e allo sviluppo di farmaci mirati agli HAT. Come gli HAT, gli HDAC giocano un ruolo critico in vari processi cellulari che coinvolgono gli istoni H3 e H4. Finora sono state identificate almeno 4 classi di HDACs. Le HDAC di classe I includono 1, 2, 3 e 8. Le HDAC di classe II sono composte da 4, 5, 6, 7, 9 e 10. Gli enzimi di classe III, noti come sirtuine, richiedono cofattori NAD+ e comprendono i SIRT 1-7. L’enzima di classe IV, che contiene solo HDAC11, ha caratteristiche sia di classe I che II. L’inibizione di HDAC mostra effetti significativi sull’apoptosi, l’arresto del ciclo cellulare e la differenziazione nelle cellule tumorali. Gli inibitori HDAC sono attualmente in fase di sviluppo come agenti antitumorali.2
Estrarre le proteine nucleari dal campione di interesse, quindi utilizzare un metodo tipo ELISA per misurare la quantità di proteine HDAC, o i livelli di attività di HDAC o i livelli di attività di HAT.
Metilazione/Demetilazione degli istoni
La metilazione degli istoni è definita come il trasferimento di uno, due o tre gruppi metilici dalla S-adenosil-L-metionina ai residui di lisina o arginina delle proteine istone da parte delle metiltransferasi (HMT). Le HMT controllano o regolano la metilazione del DNA attraverso la repressione o l’attivazione trascrizionale dipendente dalla cromatina. Nel nucleo delle cellule, quando si verifica la metilazione dell’istone, specifici geni all’interno del DNA complessato con l’istone possono essere attivati o silenziati.3 Esistono diverse metiltransferasi dell’istone che sono specifiche per il residuo di lisina o arginina che modificano. Sull’istone H3, per esempio, SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx, e SMYD3 sono istoni metiltransferasi che catalizzano la metilazione dell’istone H3 alla lisina 4 (H3-K4) nelle cellule di mammifero. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5, e Eu-HMTase sono istoni metiltransferasi che catalizzano la metilazione dell’istone H3 alla lisina 9 (H3-K9) nelle cellule dei mammiferi. G9a e gli enzimi del gruppo Polycomb come EZH2 sono istoni metiltransferasi che catalizzano la metilazione dell’istone H3 alla lisina 27 (H3-K27) nelle cellule dei mammiferi.4 Sia la metilazione di H3-K9 che di H3-K27 media la formazione di eterocromatina e partecipa anche al silenziamento dell’espressione genica nei siti eucromatici. Un’aumentata metilazione globale di H3-K27 si trova anche coinvolta in alcuni processi patologici come la progressione del cancro.
D’altra parte, la metilazione dell’arginina degli istoni H3 e H4 promuove l’attivazione trascrizionale ed è mediata da una famiglia di proteine arginina metiltransferasi (PRMTs). Ci sono 9 tipi di PRMTs trovati negli esseri umani, ma solo 7 membri sono segnalati per metilare gli istoni. Possono mediare la mono o la dimetilazione dei residui di arginina. In base alla posizione dell’aggiunta del gruppo metile, le PRMT possono essere classificate in tipo I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 e PRMT8) e tipo II (PRMT5 e PRMT7). Le PRMT di tipo II sono risultate fortemente implicate in malattie come il cancro.5 Per esempio, PRMT5 gioca un ruolo nella repressione di alcuni geni soppressori del tumore come i soppressori del tumore RB, mentre la sovraespressione di PRMT7 si osserva nel cancro al seno. Il rilevamento dell’attività e dell’inibizione delle PRMT di tipo II e di altre HMT sarebbe importante per chiarire i meccanismi di regolazione epigenetica dell’attivazione e del silenziamento dei geni, nonché per la diagnostica e la terapia del cancro.
Inizia isolando le tue proteine istone dai tuoi campioni di interesse, poi seleziona un kit ELISA appropriato per rilevare i livelli di metilazione degli istoni.
La demetilazione degli istoni è la rimozione dei gruppi metilici nelle proteine istone modificate tramite le demetilasi istone. Queste demetilasi sono state trovate per avere potenziali funzioni oncogene e coinvolgimento in altri processi patologici. La scoperta delle demetilasi degli istoni dimostra che la metilazione degli istoni non è una modifica permanente, ma piuttosto un processo più dinamico. Sono state scoperte due grandi famiglie di demetilasi: Lysine specific demethylase 1 (LSD1) e Jumonji domain containing (JmjC domain) histone demethylases (JMJD2, JMJD3/UTX e JARIDs). Il residuo aminoacidico specifico e il grado di metilazione determinano l’enzima di demetilazione. Per esempio, sull’istone H3, la lisina 4 mono- e di-metilata viene demetilata da LSD1 (BHC110, KDM1) e la lisina 4 tri-metilata da JARID (1A-1D); la lisina 27 di- e tri-metilata è demetilata da JMJD3 e UTX (KDM6A) e la lisina 9 mono- e di-metilata è demetilata da JMJD1 e la lisina 9 tri-metilata è demetilata da JMJD2.6 L’inibizione delle demetilasi dell’istone può portare alla ri-metilazione dell’istone in specifici residui importanti per la dinamica della cromatina e l’espressione genica. Inoltre, il rilevamento dell’attività e dell’inibizione di questi enzimi sarebbe importante per chiarire i meccanismi di regolazione epigenetica dell’attivazione e del silenziamento dei geni e potrebbe giovare alla diagnostica e alla terapia del cancro.
Estrarre le proteine nucleari dal campione di interesse, quindi utilizzare una tecnica basata su ELISA per indagare i livelli di attività e inibizione delle demetilasi istone delle famiglie LSD1 e JmjC-domain.
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