Soggetti e procedure di imaging
Esperimento 1 (3.0 T): Venti adulti sani (11 maschi, età 26.2 ± 3.1 anni) hanno fornito il consenso informato a partecipare all’esperimento. I dati di 16 partecipanti sono già stati riportati nel nostro studio precedente15. Quattro partecipanti sono stati appena reclutati per questo studio. I criteri di esclusione includono una significativa storia psichiatrica o neurologica. Questo studio è stato approvato dall’Università di Toronto Research Ethics Board (REB) e SickKids ospedale REB. Nessun test statistico è stato eseguito per determinare la dimensione del campione a priori. Le dimensioni del campione che abbiamo scelto sono simili a quelle utilizzate in pubblicazioni precedenti16, 26. L’esperimento è stato condotto utilizzando un sistema 3.0 T fMRI (Siemens Trio). Immagini Localizer sono stati prima raccolti per allineare il campo di vista (FOV) centrato sul cervello di ogni partecipante. T1-pesate immagini anatomiche sono state ottenute (1 mm3, 256 × 256 FOV; sequenza MPRAGE) prima dell’eco-planar imaging sperimentale (EPI) corre. Per l’imaging funzionale, una sequenza eco-planare gradiente è stato utilizzato (tempo di ripetizione (TR) = 2000 ms; tempo di eco (TE) = 27 ms; flip angle = 70 °). Ogni corsa funzionale consisteva di 263 acquisizioni del cervello intero (40 × 3.5 mm fette; acquisizione interleaved; FOV = 192 mm; dimensione della matrice = 64 × 64; risoluzione in piano di 3 mm). Le prime quattro immagini funzionali in ogni esecuzione sono stati esclusi dall’analisi per consentire l’equilibrio della magnetizzazione longitudinale.
esperimento 2 (7.0 T): Undici adulti sani (6 maschi, età 22.2 ± 2.2 anni) hanno fornito il consenso informato a partecipare all’esperimento. Questo studio è stato approvato dal comitato etico del National Institute for Physiological Sciences del Giappone. Nessun test statistico è stato eseguito per determinare la dimensione del campione a priori. Le dimensioni del campione che abbiamo scelto sono simili a quelle utilizzate in pubblicazioni precedenti16, 26. L’esperimento è stato condotto utilizzando un sistema 7.0 T fMRI (Siemens Magnetom). Immagini Localizer sono stati prima raccolti per allineare il FOV centrato sul cervello di ogni partecipante. T1-pesate immagini anatomiche sono stati ottenuti (0.75 mm isometrica, 224 × 300 FOV; sequenza MPRAGE). Per l’imaging funzionale, è stata utilizzata una sequenza eco-planare a gradiente (TR = 500 ms; TE = 25 ms; flip angle = 35°; fattore multibanda = 4). Ogni corsa funzionale consisteva di 1010 acquisizioni whole-brain (32 × fette 2.0 mm; acquisizione interleaved; FOV = 208 mm; dimensione della matrice = 104 × 104; in-plane risoluzione di 2 mm). Le prime quattro immagini funzionali in ogni esecuzione sono stati esclusi dall’analisi per consentire l’equilibrio della magnetizzazione longitudinale.
Procedure comportamentali
Sperimentazione 1: stimoli gustativi sono stati consegnati da tubi di plastica convergenti in un collettore di plastica, il cui ugello gocciolato soluzioni sapore in bocca. I tubi erano pre-riempiti in modo tale che non si osservasse quasi nessun ritardo tra la presentazione dello stimolo visivo e l’erogazione del liquido. Cento prove di soluzioni gustative sono state randomizzate e bilanciate in cinque prove. In ogni prova, 0,5 mL di soluzione gustativa sono stati erogati in 1244 ms. Quando l’erogazione del liquido terminava, uno schermo istruiva i partecipanti a deglutire il liquido (1 s). Dopo 7756 ms, sono apparse delle barre graduate per valutare la positività (3 s) e poi la negatività (3 s) del liquido. Questo è stato seguito da 0,5 mL di liquido insapore durante 1244 ms per il risciacquo, seguito dall’istruzione di deglutizione di 1 s. Dopo un intervallo di 7756 ms, iniziava la prova successiva.
Sperimento 2: Rispetto all’esperimento 1, la consegna dello stimolo gustativo differiva solo per i tempi e la quantità. Cento prove di soluzioni gustative sono state randomizzate e bilanciate in cinque prove. In ogni prova, 0,88 mL di soluzione gustativa sono stati consegnati in 2 s. Quando la consegna del liquido è terminata, uno schermo ha indicato ai partecipanti di inghiottire il liquido (2 s). Dopo 4000 ms, sono apparse delle barre graduate per valutare la positività (3 s) e poi la negatività (3 s) del liquido. Questo è stato seguito da 0,88 mL di liquido insapore durante 2 s per il risciacquo, seguito dall’istruzione di deglutizione di 2 s. Dopo un intervallo di 7 s tra le prove, iniziava la prova successiva.
Sessione pre-sperimentale
Sperimentazione 1: Per tenere conto delle differenze individuali nelle loro esperienze soggettive di gusti diversi, ai partecipanti è stato chiesto di assaggiare una gamma più ampia di intensità (misurata dalle concentrazioni molari) delle diverse soluzioni di gusto (acido, salato, amaro e dolce). In questa sessione pre-sperimentale, i partecipanti sono stati testati per 1 prova (2 mL) di ciascuna delle 16 soluzioni di gusto come segue: (1) aspro/acido citrico: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, e 1,0 × 10-2 M; (2) salato/sale da cucina: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M, e 1,0 × 10-1 M; (3) amaro/chinino solfato: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M, e 7,8 × 10-6 M; e (4) dolce/saccarosio: 1.0 M, 0.56 M, 0.32 M e 0.18 M. L’ordine di presentazione era randomizzato per gusto e poi per concentrazione all’interno di ogni gusto. Dopo aver bevuto ogni soluzione, i partecipanti hanno risciacquato e deglutito 5 mL di acqua, poi hanno valutato l’intensità e la piacevolezza (valenza) dell’esperienza della soluzione su scale separate di 1-9. Sono state selezionate le concentrazioni per ogni gusto che corrispondevano in intensità. Il lavoro precedente2 aveva dimostrato che i partecipanti hanno diverse basi di valutazione e le concentrazioni selezionate con maggiore affidabilità sono al di sopra dell’intensità media auto-riferita. Tutte le soluzioni sono state miscelate utilizzando composti chimici di grado farmaceutico da Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), sicuro per il consumo.
Sperimentazione 2: I partecipanti sono stati testati per 1 prova (1 mL) di ciascuna delle 16 soluzioni di gusto come segue: (1) dolce 1/glucosio: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M e 0,38 M; (2) dolce 2/sucralosio: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M e 0,26 × 10-4 M; (3) amaro 1/catechina: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M e 4,4 × 10-3 M; e (4) amaro 2/cloruro di magnesio: 0.4 M, 0.2 M, 0.1 M, e 0.05 M. L’ordine di presentazione era randomizzato per gusto e poi per concentrazione all’interno di ogni gusto. Dopo aver bevuto ogni soluzione, i partecipanti hanno risciacquato e deglutito 5 mL di acqua, poi hanno valutato l’intensità e la piacevolezza (valenza) dell’esperienza della soluzione su scale separate di 1-9. Sono state selezionate le concentrazioni per ogni gusto che corrispondevano in intensità. Tutte le soluzioni sono state miscelate utilizzando composti chimici di grado alimentare da DHC (catechina), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (cloruro di magnesio), Tsuruya Chemical Industries (sucralosio), e Nichiga (glucosio).
Analisi dei dati
I dati sono stati analizzati utilizzando SPM8 software (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Immagini funzionali sono stati riallineati, slice timing corretto, e normalizzato al modello MNI (ICBM 152) con interpolazione a un 2 × 2 × 2 mm spazio. I dati sono stati spazialmente lisciati (larghezza completa, mezzo massimo (FWHM) = 6 mm) per l’analisi univariata modulazione parametrica, ma non per l’analisi modello multivoxel come può compromettere le prestazioni 19. Ogni presentazione dello stimolo è stato modellato come un evento separato, utilizzando la funzione canonica in SPM8. Per ogni voxel, t-valori di prove individuali sono stati sminuiti sottraendo il valore medio tra le prove. Per visualizzare i risultati di imaging, freesurfer software39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) e SPM surfrend toolbox (scritto da I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) sono stati utilizzati dopo la modifica.
Analisi univariata
Abbiamo condotto analisi univariata per esaminare se i gusti di base erano codificati da voxel specifici nell’insula. I regressori che codificano ogni assaggiatore erano legati al tempo della presentazione dello stimolo. Le analisi univariate sono state condotte due volte: con e senza regressori di valenza edonica (Fig. 1). Per visualizzare quanta varianza potrebbe essere spiegato da regressori valenza edonica nelle regioni sensibili amaro, abbiamo selezionato voxel significativi nel contrasto “amaro vs insapore” senza valenza regresso fuori (Figura 1 supplementare). L’attività media è stata mostrata per l’attività contro la linea di base a riposo (Figura 1a supplementare), l’attività contro insapore (Figura 1b supplementare), e l’attività contro insapore con valenza regresso fuori (Figura 1c supplementare). Per testare l’esistenza di voxel-specifici di sintonizzazione del gusto, abbiamo diviso le corse dispari e pari di ogni partecipante, confrontando l’attività del voxel per ogni gusto nelle corse dispari all’attività del voxel per ogni gusto nelle corse pari. A titolo illustrativo, quando i voxel sono stati ordinati in base all’attivazione per ogni gusto nelle corse pari, abbiamo trovato modelli coerenti di attivazione corrispondentemente decrescente per tutti e quattro i gusti nelle corse dispari (Fig. 1b, Figura 4 supplementare). Le correlazioni sono state calcolate per l’attivazione voxel tra le corse dispari e pari tra tutte le combinazioni di gusto all’interno di ogni partecipante, sottoposto a un test t-campione tra i partecipanti (Fig. 1c, Fig. 4a, b). Abbiamo inoltre calcolato le correlazioni tra le corse dispari e pari per tutte le combinazioni di gusti uguali e diversi all’interno di ogni partecipante. I coefficienti di correlazione sono stati z-trasformati e sottoposti a t-test a un campione tra i partecipanti (Fig. 1d, Fig. 4b, d).
Analisi searchlight per rappresentazioni di tipo gusto
Abbiamo analizzato i dati fMRI della corteccia insulare utilizzando searchlight (raggio di 4 mm, compreso 33 voxel) analisi20. All’interno di una data sfera per ogni partecipante, un vettore è stato creato contenente il modello spaziale di BOLD-MRI segnale time-locked alla presentazione dello stimolo (normalizzato t-valori per voxel). Per valutare se i modelli di attività nelle sfere di ricerca sono in grado di discriminare i tipi di gusto, abbiamo impiegato un leave-one-stimulus-pair-out cross-validation40. In questa procedura, il classificatore LDA è stato addestrato su 38 prove, che comprendeva il tipo di gusto testato e un altro tipo di gusto (19 prove per ciascuno) e poi testato sulla coppia di stimoli left-out. Le prestazioni di classificazione per ogni gusto sono state mediate tra i confronti con altri gusti (ad esempio, le prestazioni di classificazione dell’acido sono state mediate tra acido e dolce, acido e amaro, acido e salato, e acido e insapore). A livello di individui, la precisione di classificazione del 58,7% corrispondeva a p < 0,05 non corretto. Per l’analisi di gruppo, le mappe di prestazioni di classificazione individuale sono stati lisciati con un kernel gaussiano 4 mm FWHM e poi sottoposti a un test di permutazione a un campione utilizzando SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). In questa procedura, i dati di ogni partecipante sono stati capovolti in modo casuale moltiplicando – 1 dopo aver sottratto il 50% (accuratezza del livello di probabilità) e poi sottoposti a un test t a un campione tra i partecipanti. Questo è stato permutato 10.000 volte, ottenendo la distribuzione dei t massimi all’interno dell’insula. Sulla base di questa distribuzione, la soglia del 5% FWE è stato determinato.
Analisi di congiunzione del gusto
Per l’analisi di congiunzione multi-gusto (Fig. 2b), ogni voxel è stato testato se ha superato la soglia per i quattro gusto-tipo discriminazioni dove ogni gusto-tipo discriminazione media delle prestazioni di classificazione attraverso quattro confronti (ad esempio, acido vs. dolce, acido vs. amaro, acido vs. salato, e acido vs. insapore), superiore classificazione caso (50%). L’inferenza di congiunzione valida richiede risultati significativi per tutti i confronti41. Abbiamo così contato il numero di tipi di gusto che soddisfano 5% FWE soglia in ogni voxel all’interno del insula.
Analisi di coppia gusto
Per l’analisi di coppie gusto specifico, abbiamo esaminato un ROI definito in modo indipendente all’interno del insula. In primo luogo, abbiamo usato una procedura leave-one-subject-out, escludendo ciascuno dei 20 soggetti, quindi calcolando una mappa di congiunzione a 4 gusti (cioè, voxel che soddisfano tutti i 4 contrasti di gusto descritti sopra) con i restanti 19 soggetti, ottenendo 20 mappe. La sovrapposizione di queste 20 mappe di gruppo è mostrata in Fig. 2c. I voxel della mappa che soddisfa 5% FWE soglia è stato definito come il ROI in grado di discriminazione del gusto. All’interno di questo ROI, abbiamo esaminato la discriminazione di coppie di sapori specifici, calcolando le prestazioni di classificazione di ogni coppia di sapori. Le prestazioni del gruppo sono state calcolate come la media delle prestazioni di classificazione su 20 soggetti (Fig. 2d).
Per la discriminazione delle coppie di sapori basata sulle valutazioni di valenza (Fig. 2e), abbiamo condotto un’analisi LDA utilizzando le valutazioni del soggetto di valenza (cioè, indipendente dai dati fMRI). La valenza è stata calcolata sottraendo la valutazione della negatività dalla valutazione della positività per ogni prova. La classificazione del gusto è stata calcolata usando un leave-one-trial-out addestrato sulle 19 prove rimanenti per ogni tipo di gusto.
Analisi della valenza e del tipo di gusto
Per verificare l’indipendenza del tipo di gusto dalla valenza, abbiamo esaminato la somiglianza dei dati fMRI all’interno della ROI definita dalla mappa di congiunzione dei quattro gusti di cui sopra. Per ogni soggetto, le correlazioni trial-by-trial sono stati calcolati, con conseguente 4950 (100 × 99/2) coefficienti di correlazione, ordinati in 2 × 2 categorie di tipo di gusto (stesso, diverso) × valenza edonica (stesso, diverso). I coefficienti di correlazione sono stati mediati all’interno di ogni cella per soggetto, poi i dati di tutti i soggetti sono stati sottoposti a una ANOVA a due vie a misure ripetute con il tipo di gusto e la valenza come fattori (Fig. 2g).
Abbiamo inoltre condotto un’analisi di follow-up senza dipendenza dei dati nelle correlazioni trial-by-trial attraverso le 2 × 2 celle. Abbiamo popolato casualmente ogni cella con 100 prove, ripetendo questa procedura 1.000.000 volte. Da questi, abbiamo analizzato la permutazione con la maggiore congruenza tra i fattori 2 × 2 e le categorie di prova effettive (in base alla media geometrica massima della proporzione dei dati ridotti tra le quattro celle). Abbiamo poi calcolato le correlazioni tra le prove solo all’interno di ogni cella, assicurandoci che non ci fossero dipendenze tra le celle. I coefficienti di correlazione sono stati mediati all’interno di ogni cella per soggetto, poi i dati di tutti i soggetti rimanenti sono stati sottoposti a una ANOVA a due vie a misure ripetute (Figura 3 supplementare).
I modelli di tipo di gusto differivano indipendentemente dalla valenza del gusto, cioè le mappe di discriminazione del gusto erano dissociabili dalla palatabilità. A causa della forte associazione tra tipo di gusto e valenza, le combinazioni di prova non erano uguali tra i livelli. Per esempio, la stessa valenza con diversi tipi di gusto era relativamente rara (tabella 4 supplementare). Tuttavia, questo non indica multicollinearità nella dimensione dell’effetto.
Statistica
Abbiamo analizzato i dati senza assumere una distribuzione normale, utilizzando statistiche non parametriche. Prima dell’ANOVA (Fig. 2g), è stato condotto il test di Levene per garantire il rispetto dell’ipotesi di omoscedasticità. Le correzioni di confronto multiplo sono state applicate, utilizzando la correzione di Bonferroni.
Reporting summary
Più informazioni sul disegno sperimentale sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.
