Nasza klientela w Biotage ma interesujące i zróżnicowane pochodzenie, od wysoko wykwalifikowanych chemików syntetycznych, przez ekspertów w dziedzinie chemii produktów naturalnych, po tych, którzy dopiero zaczynają swoją przygodę z chemią. W ciągu mojej ponad 40-letniej kariery w „sztuce” chromatografii nauczyłem się, że wielu z tych wspaniałych ludzi nie rozumie zasad chromatografii. Ten brak zrozumienia, jak sądzę, wynika tylko z ich podstawowego programu nauczania, w którym nauka o rozdzielaniu jest używana jako narzędzie podczas pracy laboratoryjnej, ale zasady stojące za tym, dlaczego składniki mieszaniny oddzielają się (lub nie oddzielają), być może nie są skutecznie wyjaśnione, zrozumiane lub zbadane.
Istnieją cztery podstawowe typy chromatografii, w tym:
- Chromatografia gazowo-cieczowa (GC)
- Chromatografia cieczowo-cieczowa (LLC)
- Chromatografia ciecz-ciało stałe (LSC)
- Chromatografia wykluczania wielkości/chromatografia żelowo-permeacyjna (SEC/GPC)
W tym poście skupię się na chromatografii ciecz-ciało stałe.
Chromatografia ciecz-ciało stałe
Jest to najbardziej popularna z technik wymienionych powyżej, ponieważ jest przydatna do rozdzielania związków półlotnych i nielotnych. Ponieważ do elucji związków z kolumny rozdzielającej nie jest wymagane ciepło (jak w przypadku GC), chromatografia cieczowo-stała wymaga zastosowania rozpuszczalnika lub mieszaniny mieszających się rozpuszczalników o różnej polarności, aby składniki chemiczne próbki oddzieliły się od siebie.
W przypadku LSC próbka jest umieszczana na stałym nośniku lub fazie stacjonarnej. Składniki próbki wiążą się z fazą stacjonarną, ale w różnym stopniu. Ilość interakcji z fazą stacjonarną kontroluje szybkość i efektywność separacji. Tak więc, im większe przyciąganie do fazy stacjonarnej, tym dłużej związki potrzebują na elucję. Aby pomóc w elucji tych silnie związanych związków, stosunek rozpuszczalników musi się zmieniać (zwiększając siłę) w czasie.
W obrębie LSC jest kilka różnych technik chromatograficznych…
- Chromatografia papierowa (PC)
- Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
- Wysokowydajna chromatografia cieczowa (HPLC)
- Chromatografia błyskowa (FC)
- Chromatografia jonowymienna (IX)
- Chromatografia powinowactwa (AC)
- Chiralna chromatografia (CC)
- Nadkrytyczna chromatografia cieczowa (SFC)
W tym poście skupię się na chromatografii błyskowej, której zasady działania są takie same jak HPLC. Obie wykorzystują kolumny wypełnione fazą stacjonarną, do których wstrzykiwana jest próbka i przez które pompowany jest rozpuszczalnik. Jednakże w chromatografii błyskowej stosuje się większe kolumny niż w HPLC, która jest głównie techniką rozdzielania analitycznego.
Chromatografia błyskowa jest techniką chromatografii preparatywnej, której kolumny są również wypełnione stałym nośnikiem lub podłożem, które ma większy rozmiar cząstek niż kolumny HPLC. Te różnice w wielkości nośnika i kolumny umożliwiają kolumnom flash oczyszczanie większej ilości związków na gram nośnika niż w przypadku HPLC.
- Chromatografia flash wykorzystuje cząstki nośnika o wielkości od 15 µm do nawet 60 µm
- HPLC wykorzystuje cząstki nośnika o wielkości od 1,7 µm do 10 µm
Co dzieje się wewnątrz kolumny
Większość chromatografii flash i HPLC jest wykonywana przy użyciu metodologii normalnej fazy lub odwróconej fazy. Różnice między tymi metodologiami polegają na chemii fazy stacjonarnej i rozpuszczalnikach wykorzystywanych do oddzielania poszczególnych składników chemicznych mieszaniny.
- Normalna faza wykorzystuje niepolarne i umiarkowane rozpuszczalniki (np. heksan i octan etylu) jako fazę ruchomą oraz polarne nośniki (np. krzemionkę) jako element stacjonarny.krzemionka) jako fazę stacjonarną
- Odwrócona faza jest przeciwieństwem, wykorzystuje polarne rozpuszczalniki i niepolarną fazę stacjonarną
Ponieważ te metodologie są „polarnymi” przeciwieństwami siebie (gra słów zamierzona), kolejność elucji dla większości związków jest odwrócona. To właśnie tutaj dzieje się chemia stojąca za rozdzielaniem chromatograficznym.
Skupmy się teraz na normalnej fazie.
Chromatografia normalnej fazy
W przypadku chromatografii normalnej fazy, związki chemiczne składające się na mieszaninę (np. mieszaninę reakcyjną, ekstrakt produktu naturalnego, itp.) są rozpuszczane w odpowiednim rozpuszczalniku i wstrzykiwane do kolumny. Kiedy mieszanina styka się z polarną fazą stacjonarną, powiedzmy krzemionką, związki mieszaniny i ich rozpuszczalnik konkurują z fazą ruchomą o miejsca wiążące krzemionki. Im bardziej polarna substancja chemiczna, tym silniej przyciąga się do krzemionki. To przyciąganie nazywa się adsorpcją (inną niż absorpcja).
Absorpcja jest tym, co występuje, gdy gąbka lub ręcznik papierowy wchodzi w interakcję z cieczą. Adsorpcja to połączenie oddziaływań fizycznych i chemicznych, w którym polarna powierzchnia krzemionki wiąże chemicznie składniki chemiczne, z którymi się styka, głównie dzięki zjawiskom znanym jako wiązanie wodorowe i siły van der Wallsa.
Gdy jakakolwiek substancja chemiczna wchodzi w interakcję z suchą krzemionką (stosowaną w nowej kolumnie flash), następuje adsorpcja. Interakcja ta uwalnia ciepło, które może powodować problemy ze stabilnością związków i wynikami chromatografii. Z tego powodu przed wprowadzeniem próbki kolumny krzemionkowe są zwykle wyrównywane (wstępnie zwilżane) rozpuszczalnikiem o niskiej polarności. Rozpuszczalniki o niskiej polarności (np. heksan, heptan, cykloheksan) są słabymi rozpuszczalnikami i nie są dobrze adsorbowane przez krzemionkę lub inne polarne nośniki.
Chemia powierzchni krzemionki jest mieszaniną grup hydroksylowych (silanoli) i eterów sililowych, Rysunek 1. Te grupy funkcyjne są polarne, uważane za ujemnie naładowane i adsorbują związki z niedoborem elektronów. Chmury pi związków aromatycznych mogą wiązać się wodorowo z grupami hydroksylowymi krzemionki podczas adsorpcji.1
Rysunek 1. Chemia krzemionki chromatograficznej składa się z mieszaniny silanoli i eterów sililowych. Aby zapewnić dobre wiązanie składników próbki (adsorpcję), oczyszczana próbka musi być rozpuszczona i wprowadzona do kolumny w słabym rozpuszczalniku (ładowanie ciekłe) lub rozpuszczona w silniejszym (polarnym) rozpuszczalniku, zmieszana z obojętnym medium (np. krzemionką, ziemią okrzemkową), wysuszona i wprowadzona do innej kolumny umieszczonej w linii z kolumną oczyszczającą (ładowanie suche). Suche ładowanie eliminuje wiele problemów napotykanych przy stosowaniu ładunku ciekłego, zwłaszcza w przypadku próbki rozpuszczonej w polarnym rozpuszczalniku.
Po załadowaniu próbki wprowadzane są rozpuszczalniki fazy ruchomej. Jednakże, aby osiągnąć rozdział, składniki próbki muszą desorbować z fazy stacjonarnej w różnym tempie. Chociaż jest to osiągalne przy użyciu rozpuszczalnika o stałej polarności (elucja izokratyczna), lepsze oczyszczanie jest zazwyczaj realizowane przy użyciu fazy ruchomej, która zaczyna się od niskiej polarności i zwiększa swoją polarność w czasie. Jest to znane jako elucja gradientowa.
W przypadku gradientu, związki o wyższej rozpuszczalności w rozpuszczalniku o niskiej polarności (związki o niższej polarności) desorbują jako pierwsze i przechodzą przez kolumnę. Wraz ze wzrostem polarności rozpuszczalnika fazy ruchomej, zaadsorbowane związki desorbują z nośnika z różną szybkością w oparciu o ich rozpuszczalność w coraz bardziej polarnej fazie ruchomej, Rysunek 2.
Rysunek 2. Góra – Przy elucji izokratycznej (stała polarność fazy ruchomej) związki desorbują wolniej niż przy zastosowaniu gradientu (dół). Gradient elucji zwykle zapewnia lepszą separację/oczyszczanie niż elucja izokratyczna.
Interesującą cechą chromatografii normalnej fazy jest to, że gdy związek desorbuje z nośnika, nigdy nie adsorbuje się ponownie, ponieważ coraz bardziej polarna faza ruchoma preferencyjnie adsorbuje się w jego miejsce.
Różnice polarności (siły wiązania) pomiędzy związkami mogą być tak subtelne jak dodanie innej grupy funkcyjnej, różnice w położeniu grupy funkcyjnej (Parida, 2006) jak na pierścieniu aromatycznym, lub tak wyraźne jak związki o zupełnie innej strukturze, Rysunek 3.
Rysunek 3. Rozdzielenie związków o różnej polarności na podstawie rodzaju grupy funkcyjnej i miejsca na cząsteczce. Według kolejności elucji – naftalen (brak polarnej grupy funkcyjnej), 1-nitronaftalen, o-nitroanilina, m-nitroanilina, p-nitroanilina. Nitroaniliny różnią się jedynie położeniem grupy funkcyjnej nitro w stosunku do aminy.
Podsumowując, rozdziały w chromatografii w normalnej fazie opierają się na różnicach w polarności związków (zarówno oczywistych, jak i subtelnych), ich przyciąganiu do fazy stacjonarnej i rozpuszczalności w fazie ruchomej. Aby uzyskać najlepsze wyniki oczyszczania, zalecane jest badanie rozpuszczalników za pomocą TLC.
Zainteresowanych dowiedzeniem się więcej o chromatografii błyskowej, pobierz nasz whitepaper – Successful Flash Chromatography.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
