Mikrobiologia

Wiele komórek nie jest w stanie przeprowadzać oddychania z powodu jednej lub więcej z następujących okoliczności:

1. Komórce brakuje wystarczającej ilości jakiegokolwiek odpowiedniego, nieorganicznego, końcowego akceptora elektronów do przeprowadzenia oddychania komórkowego.
2. Komórce brakuje genów do wytwarzania odpowiednich kompleksów i nośników elektronów w systemie transportu elektronów.
3. Komórce brakuje genów do wytwarzania jednego lub więcej enzymów w cyklu Krebsa.

Gdy brak odpowiedniego nieorganicznego, końcowego akceptora elektronów jest zależny od środowiska, pozostałe dwa warunki są uwarunkowane genetycznie. Tak więc, wiele prokariotów, w tym członkowie klinicznie ważnego rodzaju Streptococcus, są trwale niezdolne do oddychania, nawet w obecności tlenu. I odwrotnie, wiele prokariotów jest fakultatywnych, co oznacza, że w przypadku zmiany warunków środowiskowych w celu zapewnienia odpowiedniego nieorganicznego końcowego akceptora elektronów do oddychania, organizmy posiadające wszystkie wymagane do tego geny przełączą się na oddychanie komórkowe dla metabolizmu glukozy, ponieważ oddychanie pozwala na znacznie większą produkcję ATP na cząsteczkę glukozy.

Jeśli oddychanie nie występuje, NADH musi być ponownie utleniony do NAD+ do ponownego wykorzystania jako nośnik elektronów dla glikolizy, komórka tylko mechanizm do produkcji ATP, aby kontynuować. Niektóre systemy żywe wykorzystują cząsteczkę organiczną (zwykle pirogronian) jako końcowy akceptor elektronów w procesie zwanym fermentacją. Fermentacja nie angażuje systemu transportu elektronów i nie wytwarza bezpośrednio żadnego dodatkowego ATP poza tym, które jest produkowane podczas glikolizy w procesie fosforylacji na poziomie substratu. Organizmy przeprowadzające fermentację, zwane fermentatorami, wytwarzają maksymalnie dwie cząsteczki ATP na glukozę podczas glikolizy. Tabela 1 porównuje końcowe akceptory elektronów i metody syntezy ATP w oddychaniu tlenowym, beztlenowym i fermentacji. Należy zauważyć, że liczba cząsteczek ATP podana dla glikolizy zakłada szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa. Wskazano liczbę cząsteczek ATP wytworzonych przez fosforylację na poziomie substratu (SLP) w porównaniu z fosforylacją oksydacyjną (OP).

.

Procesy fermentacji mikrobiologicznej zostały zmanipulowane przez człowieka i są szeroko stosowane w produkcji różnych produktów spożywczych i innych produktów komercyjnych, w tym farmaceutyków. Fermentacja mikrobiologiczna może być również przydatna do identyfikacji mikrobów do celów diagnostycznych.

Fermentacja prowadzona przez niektóre bakterie, takie jak te w jogurcie i innych zakwaszonych produktach spożywczych, oraz przez zwierzęta w mięśniach podczas niedoboru tlenu, to fermentacja kwasu mlekowego. Reakcja chemiczna fermentacji kwasu mlekowego jest następująca:

tekst{Pirogronian + NADH}}

Bakterie kilku rodzajów gram-dodatnich, w tym Lactobacillus, Leuconostoc i Streptococcus, są wspólnie znane jako bakterie kwasu mlekowego (LAB), a różne szczepy są ważne w produkcji żywności. Podczas produkcji jogurtu i sera, wysoce kwaśne środowisko wytworzone przez fermentację kwasu mlekowego denaturuje białka zawarte w mleku, powodując jego krzepnięcie. Gdy kwas mlekowy jest jedynym produktem fermentacji, proces ten nazywamy fermentacją homolaktonową; tak jest w przypadku Lactobacillus delbrueckii i S. thermophiles stosowanych w produkcji jogurtów. Jednakże, wiele bakterii przeprowadza fermentację heterolaktyczną, wytwarzając mieszaninę kwasu mlekowego, etanolu i/lub kwasu octowego, a w rezultacie CO2, ze względu na wykorzystanie przez nie rozgałęzionego szlaku pentozowo-fosforanowego zamiast szlaku EMP dla glikolizy. Jednym z ważnych fermentatorów heterolaktycznych jest Leuconostoc mesenteroides, który jest używany do zakwaszania warzyw, takich jak ogórki i kapusta, produkując odpowiednio pikle i kapustę kiszoną.

Bakterie kwasu mlekowego są również ważne z medycznego punktu widzenia. Wytwarzanie środowisk o niskim pH w organizmie hamuje ustanawianie i wzrost patogenów w tych obszarach. Na przykład, mikrobiota pochwy składa się w dużej mierze z bakterii kwasu mlekowego, ale kiedy te bakterie są zmniejszone, drożdże mogą się rozmnażać, powodując infekcję drożdżakową. Dodatkowo, bakterie kwasu mlekowego są ważne w utrzymaniu zdrowia przewodu pokarmowego i jako takie są podstawowym składnikiem probiotyków.

Innym znanym procesem fermentacji jest fermentacja alkoholowa, w wyniku której powstaje etanol. Reakcja fermentacji etanolowej jest przedstawiona na rysunku 1. W pierwszej reakcji enzym dekarboksylaza pirogronianowa usuwa grupę karboksylową z pirogronianu, uwalniając gaz CO2 i wytwarzając dwuwęglową cząsteczkę aldehydu octowego. Druga reakcja, katalizowana przez enzym dehydrogenazę alkoholową, przenosi elektron z NADH na aldehyd octowy, wytwarzając etanol i NAD+. Fermentacja etanolowa pirogronianu przez drożdże Saccharomyces cerevisiae jest wykorzystywana do produkcji napojów alkoholowych, a także sprawia, że produkty chlebowe rosną dzięki produkcji CO2. Poza przemysłem spożywczym, fermentacja etanolowa produktów roślinnych jest ważna w produkcji biopaliw.

Rysunek 1. Przedstawione są tu reakcje chemiczne fermentacji alkoholowej. Fermentacja etanolowa jest ważna w produkcji napojów alkoholowych i chleba.

Poza fermentacją kwasu mlekowego i fermentacją alkoholową, wiele innych metod fermentacji występuje u prokariotów, wszystkie w celu zapewnienia odpowiedniej podaży NAD+ do glikolizy (Tabela 2). Bez tych szlaków glikoliza nie zachodziłaby, a ATP nie byłoby pozyskiwane z rozkładu glukozy. Należy zauważyć, że większość form fermentacji oprócz fermentacji homolaktycznej wytwarza gaz, zazwyczaj CO2 i/lub wodór. Wiele z tych różnych typów ścieżek fermentacyjnych jest również wykorzystywanych w produkcji żywności i każda z nich prowadzi do produkcji innych kwasów organicznych, przyczyniając się do unikalnego smaku danego fermentowanego produktu spożywczego. Kwas propionowy wytwarzany podczas fermentacji kwasu propionowego przyczynia się na przykład do charakterystycznego smaku sera szwajcarskiego.

Kilka produktów fermentacji jest ważnych z handlowego punktu widzenia poza przemysłem spożywczym. Na przykład, rozpuszczalniki chemiczne takie jak aceton i butanol są produkowane podczas fermentacji acetonowo-butanolowo-etanolowej. Złożone organiczne związki farmaceutyczne stosowane w antybiotykach (np. penicylina), szczepionkach i witaminach są wytwarzane w procesie fermentacji kwasów mieszanych. Produkty fermentacji są wykorzystywane w laboratorium do różnicowania różnych bakterii w celach diagnostycznych. Na przykład, bakterie jelitowe są znane ze swojej zdolności do przeprowadzania mieszanej fermentacji kwasowej, obniżając pH, co może być wykryte przy użyciu wskaźnika pH. Podobnie, bakteryjna produkcja acetoiny podczas fermentacji butanodiolu może być również wykryta. Wytwarzanie gazu w wyniku fermentacji może być również obserwowane w odwróconej rurce Durhama, która wychwytuje wytworzony gaz w hodowli bulionowej.

Mikroby mogą być również rozróżniane według substratów, które mogą fermentować. Na przykład, E. coli może fermentować laktozę, tworząc gaz, podczas gdy niektórzy z jej bliskich krewnych gram-ujemnych nie mogą. Zdolność do fermentacji alkoholu cukrowego sorbitolu jest wykorzystywana do identyfikacji patogennego enterokrwotocznego szczepu O157:H7 E. coli, ponieważ w przeciwieństwie do innych szczepów E. coli, nie jest on w stanie fermentować sorbitolu. Wreszcie, fermentacja mannitolowa odróżnia Staphylococcus aureus fermentujący mannitol od innych gronkowców niefermentujących mannitolu.

Identyfikacja bakterii przy użyciu paneli testowych API

Identyfikacja izolatów drobnoustrojów jest niezbędna do postawienia właściwej diagnozy i odpowiedniego leczenia pacjentów. Naukowcy opracowali techniki, które identyfikują bakterie zgodnie z ich charakterystyką biochemiczną. Zazwyczaj albo badają wykorzystanie specyficznych źródeł węgla jako substratów do fermentacji lub innych reakcji metabolicznych, albo identyfikują produkty fermentacji lub specyficzne enzymy obecne w reakcjach. W przeszłości mikrobiolodzy używali pojedynczych probówek i płytek do przeprowadzania badań biochemicznych. Jednak obecnie naukowcy, zwłaszcza z laboratoriów klinicznych, częściej używają plastikowych, jednorazowych, wielostanowiskowych paneli testowych, które zawierają szereg miniaturowych probówek reakcyjnych, z których każda zazwyczaj zawiera specyficzny substrat i wskaźnik pH. Po zaszczepieniu panelu testowego małą próbką danego mikroba i inkubacji, naukowcy mogą porównać wyniki z bazą danych, która zawiera oczekiwane wyniki dla określonych reakcji biochemicznych dla znanych mikroorganizmów, umożliwiając w ten sposób szybką identyfikację mikroba. Te panele testów pozwoliły naukowcom na obniżenie kosztów przy jednoczesnej poprawie wydajności i odtwarzalności poprzez jednoczesne wykonywanie większej liczby testów.

Wiele komercyjnych, zminiaturyzowanych paneli testów biochemicznych obejmuje szereg klinicznie ważnych grup bakterii i drożdży. Jednym z najwcześniejszych i najbardziej popularnych paneli testowych jest panel Analytical Profile Index (API) wynaleziony w latach 70-tych. Po przeprowadzeniu podstawowej charakterystyki laboratoryjnej danego szczepu, takiej jak określenie morfologii szczepu metodą Grama, można użyć odpowiedniego paska testowego, który zawiera 10 do 20 różnych testów biochemicznych do różnicowania szczepów w obrębie danej grupy drobnoustrojów. Obecnie, różne paski API mogą być używane do szybkiej i łatwej identyfikacji ponad 600 gatunków bakterii, zarówno tlenowych jak i beztlenowych, oraz około 100 różnych typów drożdży. Na podstawie kolorów reakcji, gdy obecne są produkty końcowe metabolizmu, dzięki obecności wskaźników pH, na podstawie wyników tworzony jest profil metaboliczny (Rysunek 2). Mikrobiolodzy mogą następnie porównać profil próbki z bazą danych w celu zidentyfikowania konkretnego mikroba.

Rysunek 2. Pasek testowy API 20NE jest używany do identyfikacji specyficznych szczepów bakterii Gram-ujemnych spoza rodziny Enterobacteriaceae. Oto wynik testu paskowego API 20NE dla Photobacterium damselae ssp. piscicida.