Jeśli chcemy wiedzieć, czy guz pacjenta odpowie na określony reżim terapeutyczny, musimy zbadać odpowiedź tego ludzkiego guza, a nie guza myszy, na terapię
Numerous murine models have been developed to study human cancer. Modele te są wykorzystywane do badania czynników zaangażowanych w transformację złośliwą, inwazję i przerzuty, jak również do badania odpowiedzi na terapię. Jednym z najszerzej stosowanych modeli jest ksenograft ludzkiego guza. W tym modelu, ludzkie komórki nowotworowe są przeszczepiane, albo pod skórę, albo do organu, z którego pochodzi guz, do myszy z obniżoną odpornością, które nie odrzucają ludzkich komórek. Na przykład, ksenograft zostanie łatwo zaakceptowany przez atymiczne myszy nagie, myszy z poważnie upośledzoną odpornością (SCID) lub inne myszy z obniżoną odpornością (Morton i Houghton, 2007). W zależności od liczby wstrzykniętych komórek lub wielkości przeszczepionego guza, guz będzie się rozwijał przez 1-8 tygodni (lub w niektórych przypadkach 1-4 miesięcy, lub dłużej), a odpowiedź na odpowiednie reżimy terapeutyczne może być badana in vivo. Innym rodzajem modelu zwierzęcego do badania nowotworów u ludzi jest model myszy genetycznie modyfikowanej (GEM). Profil genetyczny tych myszy jest zmieniony w taki sposób, że jeden lub kilka genów uważanych za zaangażowane w transformację lub złośliwość są zmutowane, usunięte lub nadekspresyjne; następnie efekt zmiany tych genów jest badany w czasie, a odpowiedzi terapeutyczne na te guzy mogą być śledzone in vivo. Zarówno atymiczne nagie myszy, jak i mysie modele ksenograficzne, które wykorzystują ludzkie linie komórkowe nowotworów, były używane przez dziesięciolecia, aby zwiększyć nasze zrozumienie czynników wpływających na wzrost guza; jednakże ostatnie informacje dotyczące kluczowego wpływu mikrośrodowiska guza na progresję i wzrost guza doprowadziły do większego zaufania do modeli nowotworów GEM wykorzystujących myszy immunokompetentne, jak również wykorzystanie pierwotnych ludzkich ksenograftów nowotworowych w humanizowanych modelach mysich. W rzeczywistości, modele ksenograficzne są często uważane za gorsze od modeli GEM. W tym artykule mam nadzieję pokazać, że każdy model ma swoje zastosowanie w diagnostyce nowotworów i w przedklinicznych modalnościach terapeutycznych.
Several criteria have recently been suggested for GEM models of human cancers: (1) myszy muszą być nosicielami tej samej mutacji, która występuje w ludzkich guzach; (2) mutacje powinny być zaprojektowane w obrębie endogennego locus, a nie wyrażone jako transgen; (3) zmutowane geny powinny być nieme podczas embriogenezy i wczesnego rozwoju postnatalnego, z wyjątkiem modeli dziedzicznych guzów dziecięcych; (4) mutacje powinny być w obrębie specyficznych tkanek docelowych w wybranych typach komórek; oraz (5) mutacje muszą wystąpić w ograniczonej liczbie komórek. Dodatkowe „pożądane cechy” to, że typ guza i anatomopatologia powinny być jak najbardziej podobne do tych obserwowanych w guzach ludzkich, oraz że rozwój guza powinien przebiegać przez te same lub podobne etapy „przednowotworowe” (M. Barbacid, Keystone Symposium on Inflamation, Microenvironment and Cancer, 2008, oraz komunikacja osobista). Innym ważnym kryterium, które jest trudne do osiągnięcia w modelach GEM, jest to, że środowisko gospodarz/nowotwór powinno być odtwarzalne w modelu. Ponadto, chociaż mysie modele nowotworów wykorzystujące GEM są bardzo przydatne do oceny skutków specyficznej mutacji, delecji lub amplifikacji jednego lub dwóch genów podczas progresji nowotworu u myszy, zazwyczaj nie są w stanie w pełni odtworzyć złożoności genetycznej ludzkich guzów. Na przykład, u ludzi, czerniaki złośliwe i inne typy guzów o podobnym stopniu genetycznej heterogenności wykazują rozległy stopień aneuploidii, a specyficzne wzmocnienie lub utrata genów różni się ogromnie od jednej komórki do drugiej w obrębie tego samego guza. Tak więc, podczas gdy istnieją znaczące mocne strony tego modelu, istnieją wrodzone słabości, które mogą głęboko wpłynąć na wykorzystanie tych myszy do przewidywania odpowiedzi pacjenta na terapię.
Jeśli chce się wiedzieć, czy guz pacjenta odpowie na określony reżim terapeutyczny, należy zbadać odpowiedź tego ludzkiego guza, a nie guza myszy, na terapię. To jest, gdzie ksenograft ludzkiego guza na atymicznych nagich myszach, myszach SCID, lub humanizowanych myszach z cukrzycą nieotyłościową (NOD)/SCID może być pomocny (Ryc. 1). Chociaż w modelach myszy nagich lub SCID brakuje niektórych elementów układu odpornościowego, to u atymicznych myszy nagich komórki B, komórki dendrytyczne i granulocyty są względnie nienaruszone, a ponadto u myszy tych występuje kompensacyjny wzrost aktywności komórek NK (natural killer) i makrofagów nowotworowych. Co więcej, można argumentować, że zanim te zmiany przerzutowe zostaną usunięte chirurgicznie lub poddane biopsji, guz już uniknął nadzoru immunologicznego i zabijania komórek przez komórki odpornościowe. W tym artykule omówię zalety i wady ludzkich ksenograftów nowotworowych, w porównaniu z modelami GEM, jako metody analizy potencjalnych odpowiedzi guzów pacjentów na terapię (ryc. 1).
Typy modeli mysich do badania ludzkich nowotworów.
Istnieje kilka kluczowych zalet używania ludzkich ksenograftów nowotworowych do badania odpowiedzi terapeutycznych na leki: (1) można użyć rzeczywistej ludzkiej tkanki nowotworowej, charakteryzującej się złożonością genetycznych i epigenetycznych nieprawidłowości, które istnieją w populacji ludzkich guzów; (2) ksenograftów ludzkich guzów można użyć do pomocy w rozwoju zindywidualizowanych molekularnych podejść terapeutycznych; (3) wyniki można uzyskać w ciągu kilku tygodni z biopsji ludzkiego guza w odniesieniu do odpowiedzi na terapię, podczas gdy modele GEM często wymagają aż roku, aby rozwinąć się przed terapią lekową; (5) dane z mikromacierzy tkankowych i mikromacierzy genetycznych można łatwo uzyskać z ludzkiej biopsji i tkanki ksenograftowej, przed i po terapii lekowej, w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy, zanim pacjent zostanie poddany terapii, która może okazać się nieskuteczna; (6) ortotopowe ksenografty mogą być odpowiednio umieszczone, aby odtworzyć środowisko organów, w którym rośnie guz, tak aby wpływ guza na jego mikrośrodowisko mógł być modulowany, aczkolwiek z wyjątkiem niektórych populacji komórek T; (7) stroma z mikrośrodowiska ludzkiego guza może zostać włączona do ksenograftów, aby bardziej całkowicie naśladować mikrośrodowisko ludzkiego guza; oraz 8) ksenografty wykorzystujące myszy NOD/SCID, które zostały „uczłowieczone” przez wstrzyknięcie krwi obwodowej lub komórek szpiku kostnego, pozwalają na prawie całkowitą rekonstytucję odpowiedzi immunologicznej na guz. Ksenografty wykorzystujące ludzkie linie komórkowe do testowania odpowiedzi na leki często nie korelują z aktywnością kliniczną u pacjentów (Kerbel, 2003). W przeciwieństwie do tego, gdy pierwotne guzy są używane jako ortotopowy ksenograft, istnieje silniejsza wartość predykcyjna odpowiedzi, szczególnie gdy stosowana jest klinicznie odpowiednia dawka leku (Johnson et al., 2001; Kerbel, 2003; Scholz et al., 1990). Istnieją trzy różne rodzaje odpowiedzi na leczenie, które mogą być oceniane: wpływ na tempo wzrostu guza, wpływ na kurczenie się/regresję guza oraz przeżycie. Wpływ leku na tempo wzrostu guza lub cytostazę jest często bardziej predykcyjny dla odpowiedzi klinicznej niż kurczenie się/regresja guza (Kelland, 2004). Co więcej, podskórne modele guza, które nie są ortotopowe i nie reprezentują odpowiednich miejsc dla ludzkich guzów, nie są predykcyjne, kiedy są używane do testowania odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe (Killion et al., 1998). Wyzwaniem związanym z modelami ortotopowymi, w porównaniu z modelami podskórnymi, jest trudność w śledzeniu wzrostu guza. Jednakże, ostatni rozwój nowych technik obrazowania rezonansu magnetycznego (MRI) i mikroobrazowania może zminimalizować ten problem.
Istnieje kilka innych wad i wyzwań związanych z wykorzystaniem mysiego modelu ksenograftów do monitorowania i/lub przewidywania odpowiedzi terapeutycznych w nowotworach. Ortotopowe modele nowotworów są czasochłonne, drogie i technicznie trudne. Ponadto, jeśli używane są atymiczne myszy nagie lub SCID, odpowiedź limfocytów na guz jest utracona, tj. myszy nagie tracą niektóre odpowiedzi komórek T, a myszy SCID tracą zarówno swoje odpowiedzi komórek T i B. Jednakże, te deficyty immunologiczne mogą, w zasadzie, być w dużym stopniu przezwyciężone poprzez przeszczepianie ludzkich guzów na „uczłowieczone” myszy NOD/SCID. To znacznie zmniejsza wiele wad ortotopowych modeli ksenograftów ludzkich guzów do badania odpowiedzi terapeutycznej. Jednakże, pełne odtworzenie układu odpornościowego u „humanizowanej myszy” nie jest możliwe, ponieważ przywrócenie elementów selekcjonujących HLA klasy I i klasy II w populacjach limfocytów T pozostaje wyzwaniem (Bernard i in., 2008). Ponadto, aby przeprowadzić te eksperymenty, nowonarodzone myszy muszą być napromieniowane, a następnie wszczepione ludzkimi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi CD34+ z ludzkiej krwi pępowinowej. Czas pozyskania krwi pępowinowej, napromieniowania nowonarodzonych myszy i weryfikacji uczłowieczonego fenotypu myszy NOD/SCID po wszczepieniu, czyni tę procedurę dość kłopotliwą, ale bardzo wartościową.
Pomimo wad modelu ksenograftów w przewidywaniu odpowiedzi klinicznej na terapię, istnieje szereg ważnych sukcesów. Na przykład, ksenografty linii komórkowych szpiczaka mnogiego u myszy syngenicznych reagują na inhibitor proteasomu, bortezomib/VELCADE®, który okazał się bardzo obiecujący w leczeniu szpiczaka mnogiego (LeBlanc i in., 2002; Moreau i in., 2008; Oyajobi i Mundy, 2003). Po raz pierwszy wykazano, że połączenie bortezomibu i melphalenu jest skuteczne w leczeniu szpiczaka mnogiego w przedklinicznych badaniach ksenograftów, co doprowadziło do sukcesu w badaniach klinicznych, a następnie stało się zalecanym nowym standardem opieki klinicznej dla pacjentów ze szpiczakiem mnogim w wieku powyżej 65 lat (Mateos i in., 2006; Mitsiades i in., 2003). Wykazano, że Herceptyna zwiększa aktywność przeciwnowotworową paklitakselu i doksorubicyny wobec ksenograftów ludzkiego raka piersi wykazujących ekspresję HER2/neu, co doprowadziło do kolejnych udanych badań klinicznych (Baselga i in., 1998; Sporn i Bilgrami, 1999). Przeciwciała neutralizujące receptor 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR2) w połączeniu z paklitakselem okazały się skuteczne w hamowaniu wzrostu guza i przerzutów w ortotopowym modelu ksenograftów (Davis i in., 2004). Następnie opracowano bevacizumab, humanizowane przeciwciało monoklonalne, które celuje w czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A). Bevacizumab okazał się skuteczny w badaniach klinicznych III fazy w raku jelita grubego i nerki i został zatwierdzony przez FDA w 2004 roku (Hurwitz i in., 2004; Yang i in., 2003). Co więcej, mysie modele ksenograftów są przydatne do przewidywania toksyczności terapii celowanych, a w innych przypadkach do identyfikacji możliwych biomarkerów predykcyjnych modulacji celu. Chociaż to tylko kilka przykładów udanego wykorzystania badań ksenograftów, wyraźnie, dla wielu typów ludzkich guzów, informacje uzyskane z ortotopowych badań ksenograftów na myszach z wykorzystaniem ludzkich guzów doprowadziły do informacji, które zostały przełożone na udane próby kliniczne.
Zaletami GEM jest to, że: (1) myszy są immunokompetentne, tak że mikrośrodowisko guza może być odzwierciedlone w jak największym stopniu w modelu guza u myszy; (2) specyficzne nieprawidłowości genetyczne, które są obecne w ludzkich guzach mogą być odtworzone, w sposób indukowalny, w określonym wieku w typie tkanki pochodzenia; (3) etapy progresji guza mogą być badane w czasie; i (4) kilka podejść terapeutycznych może być badanych na różnych etapach rozwoju guza. Modele genetyczne są również przydatne w humanizowanych myszach, gdzie ludzkie geny, takie jak geny cytochromu P450 lub ludzkie antygeny nowotworowe, są wyrażane u myszy w celu śledzenia metabolizmu leków lub odpowiedzi immunologicznej na guz (Talmadge i in., 2007). Wadą GEM jest, po pierwsze, że złożoność ludzkiego guza nie może być wiarygodnie naśladowana, a po drugie, guzy mysie nie są guzami ludzkimi i nie często przewidują, co się stanie w ludzkim guzie w odniesieniu do odpowiedzi terapeutycznej. Możemy wyleczyć wiele guzów mysich, ale nie ma bezpośredniej korelacji między odpowiedzią u myszy a odpowiedzią w klinice.
Podsumowując, zarówno ortotopowy ksenograficzny przeszczep ludzkiego guza jak i modele GEM są użyteczne dla zwiększenia naszego zrozumienia rozwoju i leczenia raka. Każdy z nich ma swoje mocne strony i ograniczenia, przy czym ortotopowy xenograft ludzkiego guza jest doskonały do przewidywania odpowiedzi na leki w ludzkich guzach, a model GEM jest najlepszy do badania roli specyficznych genów w rozwoju i progresji nowotworu. Niezależnie od tego, który model jest używany do przewidywania odpowiedzi klinicznej u pacjentów, ważne jest, aby uzyskać co najmniej 50% zahamowanie wzrostu guza, aby uzyskać kwalifikowaną „odpowiedź” na terapię, oraz aby stosować klinicznie odpowiednie dawki środków terapeutycznych i monitorować przeżycie. Ponadto ważne jest określenie, czy wzrost guza powraca po odstawieniu leku, a jeśli tak, to czy ponowny wzrost jest szybszy, gdy leczenie jest wstrzymane w porównaniu z okresem przed rozpoczęciem leczenia. Jeśli tak jest, pomimo jakiejkolwiek odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, efekt z odbicia odradza stosowanie tego schematu leczenia farmakologicznego dla typów nowotworów wykazujących efekt z odbicia. Podsumowując, nie mamy idealnych modeli mysich guzów ludzkich, ale musimy nauczyć się interpretować nasze dane w ramach ograniczeń użytego testu.
.
