Uma modificação histone é uma modificação pós-tradução covalente (PTM) para as proteínas histone que inclui metilação, fosforilação, acetilação, ubiquilação e sumoilação. Os PTMs feitos às histonas podem impactar a expressão gênica alterando a estrutura da cromatina ou recrutando modificadores de histona. As proteínas do histone atuam para embalar o DNA, que envolve em torno dos oito histones, em cromossomos. As modificações do histone atuam em diversos processos biológicos, como a ativação/inativação transcripcional, o acondicionamento cromossômico e os danos/reparações do DNA. Na maioria das espécies, a histona H3 é primeiramente acetilada nas lisinas 9, 14, 18, 23 e 56, metilada na arginina 2 e lisinas 4, 9, 27, 36 e 79, e fosforilada nos ser10, ser28, Thr3 e Thr11. A histona H4 é principalmente acetilada nas lisinas 5, 8, 12 e 16, metilada na arginina 3 e lisina 20, e fosforilada na serina 1. Assim, a detecção quantitativa de várias modificações histônicas forneceria informações úteis para uma melhor compreensão da regulação epigenética dos processos celulares e do desenvolvimento de drogas que modificam a história da enzima alvo.
Acetilação/Deactilação da Histona
Acetilação da Histona ocorre pela adição enzimática de um grupo acetil (COCH3) a partir da acetil coenzima A. O processo de acetilação da história está fortemente envolvido na regulação de muitos processos celulares incluindo a dinâmica e transcrição da cromatina, silenciamento de genes, progressão do ciclo celular, apoptose, diferenciação, replicação de DNA, reparação de DNA, importação nuclear e repressão neuronal. As enzimas modificadoras envolvidas na acetilação de histona são chamadas de acetiltransferases de histona (HATs) e desempenham um papel crítico no controle da acetilação de histona H3 e H4. Foram identificados mais de 20 HATs que podem ser classificados em cinco famílias: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP, e coactivadores de receptores nucleares como ACTR.1 A acetilação de histona H3 pode ser aumentada pela inibição das deacetílases histônicas (HDACs) e diminuída pela inibição do HAT.
Diacetilaces de histerona (HDACs) catalisam a remoção hidrolítica dos grupos acetil dos resíduos de lisina histona. Um desequilíbrio no equilíbrio da acetilação da histona tem sido associado com a tumorigenese e progressão do câncer. Detectar se a histona H3 é acetilada em seus resíduos de lisina forneceria informações úteis para uma melhor caracterização dos padrões ou locais de acetilação, levando assim a uma melhor compreensão da regulação epigenética da ativação gênica, assim como o desenvolvimento de drogas direcionadas para o HAT. Similar aos HATs, os HDACs desempenham um papel crítico em vários processos celulares envolvendo o histone H3 e H4. Até agora, foram identificadas pelo menos 4 classes de HDACs. Os HDACs classe I incluem 1, 2, 3, e 8. Os HDACs Classe II são compostos por 4, 5, 6, 7, 9, e 10. As enzimas classe III, conhecidas como sirtuínas, requerem cofactores NAD+ e incluem os SIRTs 1-7. A enzima Classe IV, que contém apenas HDAC11, tem características tanto da Classe I como da II. A inibição do HDAC apresenta efeitos significativos na apoptose, parada do ciclo celular e diferenciação nas células cancerígenas. Os inibidores de HDAC estão sendo desenvolvidos atualmente como agentes anticancerígenos.2
Extraia suas proteínas nucleares de sua amostra de interesse, então utilize um método semelhante ao ELISA para medir a quantidade de proteínas HDAC, ou os níveis de atividade do HDAC ou níveis de atividade do HAT.
Metilação/Demetilação de Histona
Metilação de Histona é definida como a transferência de um, dois ou três grupos metilo de S-adenosil-L-metionina para lisina ou resíduos de arginina de proteínas histona por metiltransferases histona (HMTs). As HMTs controlam ou regulam a metilação do DNA através da repressão ou ativação transcripcional dependente da cromatina. No núcleo celular, quando ocorre a metilação da histona, genes específicos dentro do DNA complexado com a histona podem ser ativados ou silenciados.3 Existem várias metansferases diferentes de histona que são específicas para os resíduos de lisina ou arginina que eles modificam. Na histona H3, por exemplo, SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx e SMYD3 são as metiltransferases histônicas que catalisam a metilação da histona H3 na lisina 4 (H3-K4) em células de mamíferos. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5, e Eu-HMTase são metiltransferases histónicas que catalisam a metilação da histona H3 na lisina 9 (H3-K9) em células de mamíferos. A G9a e as enzimas do grupo policarbonato como a EZH2 são metiltransferases histonais que catalisam a metilação da histona H3 na lisina 27 (H3-K27) em células de mamíferos.4 Tanto a metilação H3-K9 quanto a H3-K27 são mediadoras da formação da heterocromatina e também participam do silenciamento da expressão gênica em locais eucromáticos. O aumento global da metilação H3-K27 também está envolvido em alguns processos patológicos, como a progressão do câncer.
Por outro lado, a metilação arginina das histonas H3 e H4 promove a ativação transcripcional e é mediada por uma família de proteínas argininas metiltransferases (PRMTs). Existem 9 tipos de PRMTs encontradas em humanos, mas apenas 7 membros são relatados para as histonas metilatadas. Eles podem mediar a mono ou dimetilação de resíduos de arginina. Com base na posição da adição do grupo metilo, os PRMTs podem ser classificados em tipo I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6, e PRMT8) e tipo II (PRMT5 e PRMT7). Verifica-se que as PRMT do tipo II estão fortemente implicadas em doenças como o cancro.5 Por exemplo, a PRMT5 desempenha um papel na repressão de certos genes supressores de tumores, como os supressores de tumores RB, enquanto que a sobreexpressão da PRMT7 é observada no cancro da mama. A detecção da atividade e inibição de PRMT tipo II, bem como de outros HMTs, seria importante para elucidar os mecanismos de regulação epigenética da ativação e silenciamento gênico, bem como beneficiar o diagnóstico e a terapêutica do câncer.
Comece isolando as suas proteínas histónicas das suas amostras de interesse, depois seleccione um kit ELISA apropriado para detectar os níveis de metilação histónica.
Desmetilação histónica é a remoção de grupos metilo nas proteínas histónicas modificadas através das desmetilações histónicas. Estas demetilases têm sido encontradas com potenciais funções oncogénicas e envolvimento em outros processos patológicos. A descoberta das desmetilases histônicas demonstra que a metilação histônica não é uma modificação permanente, mas sim um processo mais dinâmico. Foram descobertas duas grandes famílias de demetilases: A demetilase específica da lisina 1 (LSD1) e o domínio Jumonji contendo (domínio JmjC) histone demethylases (JMJD2, JMJD3/UTX e JARIDs). O resíduo específico de aminoácidos e o grau de metilação determinam a enzima de desmetilação. Por exemplo, na histona H3, a mono e a lisina dimetilada 4 são desmetiladas por LSD1 (BHC110, KDM1) e a lisina trimetilada 4 por JARID (1A-1D); a lisina 27 di- e trimetilada é desmetilada pelo JMJD3 e UTX (KDM6A) e a lisina 9 mono e di-metilada é desmetilada pelo JMJD1 e a lisina 9 trimetilada é desmetilada pelo JMJD2.6 A inibição das desmetilases histônicas pode levar à re-metilação histônica em resíduos específicos importantes para a dinâmica da cromatina e expressão gênica. Além disso, a detecção da atividade e inibição dessas enzimas seria importante na elucidação dos mecanismos de regulação epigenética da ativação e silenciamento gênico e pode beneficiar o diagnóstico e a terapêutica do câncer.
Extraia suas proteínas nucleares da sua amostra de interesse, depois utilize uma técnica baseada em ELISA para investigar a atividade e os níveis de inibição das desmetilases histônicas das famílias LSD1 e JmjC-domínio.
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