Representações distintas das qualidades gustativas básicas no córtex gustativo humano

Subjects and imaging procedures

Experiment 1 (3.0 T): Vinte adultos saudáveis (11 homens, idade 26,2 ± 3,1 anos) deram o consentimento informado para participar do experimento. Os dados de 16 participantes já foram relatados em nosso estudo anterior15. Quatro participantes foram recrutados recentemente para este estudo. Os critérios de exclusão incluem histórico psiquiátrico ou neurológico significativo. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade de Toronto (REB) e pelo hospital SickKids REB. Nenhum teste estatístico foi realizado para determinar o tamanho da amostra a priori. Os tamanhos de amostra escolhidos são similares aos usados em publicações anteriores16, 26. O experimento foi conduzido usando um sistema de fMRI 3.0 T (Siemens Trio). As imagens do localizador foram coletadas primeiro para alinhar o campo de visão (FOV) centrado no cérebro de cada participante. As imagens anatômicas ponderadas em T1 foram obtidas (1mm3, 256 × 256 FOV; seqüência MPRAGE) antes da realização do ecoplano experimental (EPI). Para imagens funcionais, foi utilizada uma seqüência eco-planar gradiente (tempo de repetição (TR) = 2000 ms; tempo de eco (TE) = 27 ms; ângulo de viragem = 70°). Cada execução funcional consistiu de 263 aquisições de todo o cérebro (cortes de 40 × 3,5 mm; aquisição intercalada; FOV = 192 mm; tamanho da matriz = 64 × 64; resolução no plano de 3 mm). As primeiras quatro imagens funcionais em cada run foram excluídas da análise para permitir o equilíbrio da magnetização longitudinal.

Experiment 2 (7.0 T): Onze adultos saudáveis (6 homens, idade 22,2 ± 2,2 anos) deram o consentimento informado para participar do experimento. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto Nacional de Ciências Fisiológicas do Japão. Nenhum teste estatístico foi realizado para determinar o tamanho da amostra a priori. Os tamanhos de amostra escolhidos são similares aos utilizados em publicações anteriores16, 26. O experimento foi conduzido usando um sistema de fMRI 7.0 T (Siemens Magnetom). As imagens do localizador foram coletadas primeiramente para alinhar o FOV centrado no cérebro de cada participante. Foram obtidas imagens anatômicas ponderadas em T1 (isométrica 0,75mm, FOV 224 × 300; seqüência MPRAGE). Para imagens funcionais, foi utilizada uma seqüência eco-planar gradiente (TR = 500 ms; TE = 25 ms; ângulo de viragem = 35°; fator multibandas = 4). Cada execução funcional consistiu de 1010 aquisições de todo o cérebro (cortes de 32 × 2,0 mm; aquisição intercalada; FOV = 208 mm; tamanho da matriz = 104 × 104; resolução no plano de 2 mm). As quatro primeiras imagens funcionais em cada run foram excluídas da análise para permitir o equilíbrio da magnetização longitudinal.

Procedimentos comportamentais

Experimento 1: Os estímulos gustativos foram fornecidos por tubos plásticos convergindo em um coletor plástico, cujo bico gotejou soluções gustativas para a boca. Os tubos foram pré-enchidos de tal forma que quase nenhum atraso entre a apresentação do estímulo visual e a entrega do líquido foi observado. Cem testes de soluções gustativas foram randomizados e balanceados em cinco corridas. Em cada ensaio, 0,5 mL de solução gustativa foi entregue ao longo de 1244 ms. Quando a entrega do líquido terminou, uma tela instruiu os participantes a engolir o líquido (1 s). Depois de 7756 ms, as barras de escala pareciam avaliar a positividade (3 s) e, em seguida, a negatividade (3 s) do líquido. Isto foi seguido por 0,5 mL do líquido sem sabor durante 1244 ms para o enxágue, seguido pela instrução de 1 s de deglutição. Após um intervalo de 7756 ms entre ensaios, o próximo ensaio começou.

Experimento 2: Em comparação com o Experimento 1, a entrega do estímulo gustativo diferiu apenas em seu tempo e quantidade. Cem testes de solução gustativa foram randomizados e equilibrados em cinco séries. Em cada ensaio, 0,88 mL de solução gustativa foi entregue durante 2 s. Quando a entrega do líquido terminou, uma tela instruiu os participantes a engolir o líquido (2 s). Depois de 4000 ms, as barras de escala pareciam avaliar a positividade (3 s) e, em seguida, a negatividade (3 s) do líquido. Isto foi seguido por 0,88 mL do líquido sem sabor durante 2 s para o enxágue, seguido pela instrução de 2 s de deglutição. Após um intervalo de 7 s entre ensaios, o próximo ensaio começou.

Sessão pré-experimental

Experimento 1: Para explicar as diferenças individuais em suas experiências subjetivas de gostos diferentes, foi pedido aos participantes que provassem uma gama mais ampla de intensidades (medidas pelas concentrações molares) das diferentes soluções gustativas (azedo, salgado, amargo e doce). Nesta sessão pré-experimental, os participantes foram testados para 1 ensaio (2 mL) de cada uma das 16 soluções gustativas, como se segue: (1) ácido cítrico/azedo: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, e 1,0 × 10-2 M; (2) salgado/sal de mesa: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M, e 1,0 × 10-1 M; (3) sulfato amargo/quinina: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M, e 7,8 × 10-6 M; e (4) doce/sucarose: 1,0 M, 0,56 M, 0,32 M, e 0,18 M. A ordem de apresentação foi aleatória por gosto e depois por concentração dentro de cada gosto. Após beber cada solução, os participantes enxaguaram e engoliram 5 mL de água, em seguida classificaram a intensidade e o prazer (valência) da experiência da solução em escalas separadas de 1-9. As concentrações para cada gosto que correspondiam em intensidade foram selecionadas. Trabalhos anteriores2 mostraram que os participantes têm diferentes linhas de base de classificação e as concentrações mais fidedignamente selecionadas estão acima da intensidade média auto-relatada. Todas as soluções foram misturadas usando compostos químicos de grau farmacêutico da Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), seguros para consumo.

Experimento 2: Os participantes foram testados para 1 ensaio (1 mL) de cada uma das 16 soluções gustativas, como se segue: (1) doce 1/glucose: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M e 0,38 M; (2) doce 2/sucralose: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M e 0,26 × 10-4 M; (3) amargo 1/catecina: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M e 4,4 × 10-3 M; e (4) cloreto de magnésio amargo 2/magnésio: 0,4 M, 0,2 M, 0,1 M, e 0,05 M. A ordem de apresentação foi aleatória por gosto e depois por concentração dentro de cada gosto. Após beber cada solução, os participantes enxaguaram e engoliram 5 mL de água, depois classificaram a intensidade e o prazer (valência) da experiência da solução em escalas separadas de 1-9. As concentrações para cada gosto que corresponderam em intensidade foram selecionadas. Todas as soluções foram misturadas utilizando compostos químicos de qualidade alimentar de DHC (cathechin), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (cloreto de magnésio), Tsuruya Chemical Industries (sucralose), e Nichiga (glicose).

Análise de dados

Dados foram analisados utilizando o software SPM8 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). As imagens funcionais foram realinhadas, o tempo das fatias corrigido e normalizadas para o modelo MNI (ICBM 152) com interpolação para um espaço de 2 × 2 × 2 mm. Os dados foram suavizados espacialmente (largura total, meio máximo (FWHM) = 6 mm) para análise de modulação paramétrica univariada, mas não para análise de padrão multivoxel, pois pode prejudicar o desempenho19. Cada apresentação de estímulos foi modelada como um evento separado, usando a função canônica em SPM8. Para cada voxel, os valores t de ensaios individuais foram rebaixados pela subtração do valor médio entre ensaios. Para visualizar os resultados das imagens, foram utilizados softwares freesurfer39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) e SPM surfrend toolbox (escrito por I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) após modificação.

Análise univariada

Realizamos análises univariadas para examinar se os gostos básicos foram codificados por voxels específicos na ínsula. Regressores que codificam cada tastante foram bloqueados no tempo para a apresentação dos estímulos. As análises univariadas foram realizadas duas vezes: com e sem regressores de valência hedônica (Fig. 1). Para visualizar quanta variância poderia ser explicada pelos regressores de valência hedônica nas regiões sensíveis ao amargo, selecionamos voxels significativos no contraste “amargo vs. insípido” sem regressão de valência (Figura Complementar 1). A atividade média foi mostrada para atividade contra base de repouso (Figura Complementar 1a), atividade contra insípida (Figura Complementar 1b), e atividade contra insípida com valência regredida para fora (Figura Complementar 1c). Para testar a existência de ajuste de sabor específico para voxel, dividimos a atividade voxel de cada participante nas corridas pares e ímpares, comparando a atividade voxel para cada sabor nas corridas pares com a atividade voxel para cada sabor nas corridas pares. Para ilustração, quando os voxels foram ordenados com base na ativação para cada sabor nas séries pares, encontramos padrões consistentes de ativação decrescente correspondente para os quatro sabores nas séries ímpares (Fig. 1b, Figura Suplementar 4). Correlações foram computadas para ativação de voxels entre odd runs e even runs entre todas as combinações de sabores dentro de cada participante, submetidas ao teste t de uma amostra entre os participantes (Fig. 1c, Fig. 4a, b). Foram ainda computadas correlações entre odd e even runs para todas as combinações de sabores e diferentes combinações de sabores dentro de cada participante. Os coeficientes de correlação foram transformados em z e submetidos ao teste t de uma amostra entre os participantes (Fig. 1d, Fig. 4b, d).

Análise de fMRI do córtex insular usando a análise do holofote (raio de 4 mm, incluindo 33 voxels)20. Dentro de uma determinada esfera para cada participante, foi criado um vetor contendo o padrão espacial do sinal de BOLD-MRI, com tempo travado para a apresentação do estímulo (valores t normalizados por voxel). Para avaliar se os padrões de atividade nas esferas do holofote são capazes de discriminar os tipos de sabor, empregamos uma validação cruzada de pares de estímulos40. Neste procedimento, o classificador LDA foi treinado em 38 ensaios, que incluíram o tipo de sabor testado e outro tipo de sabor (19 ensaios para cada um) e, em seguida, testado no par de estímulos de esquerda para fora. O desempenho da classificação para cada sabor foi avaliado em média em comparação com outros sabores (por exemplo, o desempenho da classificação azeda foi avaliado em média entre azedo x doce, azedo x amargo, azedo x salgado e azedo x sem sabor). Ao nível dos indivíduos, 58,7% de precisão na classificação correspondeu a p < 0,05 não corrigido. Para análise de grupo, os mapas de desempenho da classificação individual foram suavizados com um grão de 4 mm FWHM Gaussiano e depois submetidos a um teste de permutação de uma amostra usando SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). Neste procedimento, os dados de cada participante foram aleatoriamente invertidos multiplicando-se – 1 após subtrair 50% (precisão do nível de chance) e depois submetidos a um teste de uma amostra t entre os participantes. Isto foi permutado 10.000 vezes, resultando na distribuição do t máximo dentro da ínsula. Com base nesta distribuição, o limiar de 5% de FWE foi determinado.

Análise de conjunção do sabor

Para a análise de conjunção de múltiplos sabores (Fig. 2b), cada voxel foi testado se excedeu o limiar para as quatro discriminações por tipo de sabor, em que cada discriminação por tipo de sabor obteve a média do desempenho da classificação através de quatro comparações (por exemplo, azedo vs. doce, azedo vs. amargo, azedo vs. salgado e azedo vs. sem sabor), excedendo a classificação de probabilidade (50%). A inferência de conjunção válida requer resultados significativos para todas as comparações41. Assim, contamos o número de tipos de sabores que satisfazem o limiar de 5% de FWE em cada voxel dentro da ínsula.

Análise de pares de sabores

Para análise de pares de sabores específicos, examinamos um ROI definido independentemente dentro da ínsula. Primeiro, usamos um procedimento de leave-one-subject-out, excluindo cada um dos 20 sujeitos, depois calculamos um mapa de conjunto de 4 sabores (ou seja, voxels satisfazendo todos os 4 contrastes de sabores descritos acima) com os 19 sujeitos restantes, resultando em 20 mapas. A sobreposição destes 20 mapas de grupo é mostrada na Fig. 2c. Os voxels do mapa que satisfazem o limite de 5% de FWE foram definidos como o ROI capaz de discriminar o gosto. Dentro deste ROI, examinamos a discriminação de pares de paladares específicos, calculando o desempenho da classificação de cada par de paladares. O desempenho do grupo foi computado como o desempenho médio da classificação em 20 sujeitos (Fig. 2d).

Para a discriminação dos pares de sabores com base nas classificações de valência (Fig. 2e), realizamos uma análise LDA usando classificações de valência dos sujeitos (ou seja, independente dos dados da fMRI). A valência foi calculada subtraindo a classificação de negatividade da classificação de positividade para cada estudo. A classificação do gosto foi calculada usando um leave-one-trial-out treinado nos 19 ensaios restantes para cada tipo de gosto.

Análise de valência e tipo de gosto

Para testar a independência do tipo de gosto da valência, examinamos a similaridade dos dados de fMRI dentro do ROI definido pelo mapa de conjunção de quatro gostos acima. Para cada sujeito, foram calculadas correlações prova a prova, resultando em 4950 (100 × 99/2) coeficientes de correlação, ordenados em 2 × 2 categorias de tipo de gosto (igual, diferente) × valência hedônica (igual, diferente). Os coeficientes de correlação foram calculados dentro de cada célula por sujeito, então todos os dados dos sujeitos foram submetidos a uma ANOVA de duas medidas repetidas, com tipo de sabor e valência como fatores (Fig. 2g).

Antes, realizamos uma análise de acompanhamento sem dependência de dados nas correlações estudo a estudo através das 2 × 2 células. Nós preenchemos aleatoriamente cada célula com os 100 ensaios, repetindo este procedimento 1.000.000 vezes. A partir destes, analisamos a permutação com a maior congruência entre os fatores 2 × 2 e as categorias reais do estudo (com base na média geométrica máxima da proporção dos dados reduzidos entre as quatro células). Em seguida, calculamos as correlações entre os ensaios apenas dentro de cada célula, garantindo que não haja dependência entre as células. Os coeficientes de correlação foram calculados em média dentro de cada célula por sujeito, então todos os dados dos sujeitos restantes foram submetidos a uma ANOVA (Figura Suplementar 3).

Taste-type patterns differed independently of taste valence, i.e., os mapas de discriminação gustativa foram dissociáveis da palatabilidade. Devido à forte associação entre o tipo de sabor e a valência, as combinações dos testes não foram iguais em todos os níveis. Por exemplo, a mesma valência com diferentes tipos de sabor era relativamente rara (Tabela Suplementar 4). Entretanto, isto não indica multicolinearidade no tamanho de efeito.

Estatística

Analisamos os dados sem assumir distribuição normal, usando estatísticas não paramétricas. Antes da ANOVA (Fig. 2g), foi realizado o teste de Levene para garantir que a suposição de homocedasticidade fosse atendida. Correções de comparação múltipla foram aplicadas, usando a correção de Bonferroni.

Síntese do relatório

Outras informações sobre desenho experimental estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.