O modificare histonică este o modificare post-translațională covalentă (PTM) a proteinelor histonice care include metilarea, fosforilarea, acetilarea, ubiquitylarea și sumoylarea. PTM-urile efectuate asupra histonelor pot avea un impact asupra expresiei genelor prin alterarea structurii cromatinei sau prin recrutarea modificatorilor histonici. Proteinele histone acționează pentru a împacheta ADN-ul, care se înfășoară în jurul celor opt histone, în cromozomi. Modificările histonice acționează în diverse procese biologice, cum ar fi activarea/inactivarea transcripțională, împachetarea cromozomilor și deteriorarea/repararea ADN-ului. La majoritatea speciilor, histona H3 este în principal acetilată la nivelul lizinelor 9, 14, 18, 23 și 56, metilată la nivelul argininei 2 și al lizinelor 4, 9, 27, 36 și 79, și fosforilată la ser10, ser28, Thr3 și Thr11. Histona H4 este în principal acetilată la nivelul lizinelor 5, 8, 12 ș i 16, metilată la arginina 3 ș i lizina 20 ș i fosforilată la serina 1. Astfel, detectarea cantitativă a diferitelor modificări ale histonelor ar furniza informații utile pentru o mai bună înțelegere a reglării epigenetice a proceselor celulare și pentru dezvoltarea de medicamente care să vizeze enzimele modificatoare de histone.
Acetilarea/Deacetilarea histonelor
Acetilarea histonelor are loc prin adăugarea enzimatică a unei grupări acetil (COCH3) din acetil coenzima A. Procesul de acetilare a histonelor este strâns implicat în reglarea multor procese celulare, inclusiv dinamica cromatinei și transcripția, reducerea la tăcere a genelor, progresia ciclului celular, apoptoza, diferențierea, replicarea ADN, repararea ADN, importul nuclear și reprimarea neuronală. Enzimele modificatoare implicate în acetilarea histonelor se numesc histone acetiltransferaze (HAT) și joacă un rol esențial în controlul acetilării histonelor H3 și H4. Au fost identificate mai mult de 20 de HAT-uri, care pot fi clasificate în cinci familii: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP și coactivatorii receptorilor nucleari, cum ar fi ACTR.1 Acetilarea histonei H3 poate fi crescută prin inhibarea histone deacetilazelor (HDAC) și diminuată prin inhibarea HAT.
Histone deacetilazele (HDAC) catalizează eliminarea hidrolitică a grupărilor acetil din reziduurile de lizină ale histonei. Un dezechilibru în echilibrul acetilării histonelor a fost asociat cu tumorigeneza și progresia cancerului. Detectarea faptului dacă histona H3 este acetilată la nivelul reziduurilor sale de lizină ar oferi informații utile pentru caracterizarea ulterioară a modelelor sau a situsurilor de acetilare, conducând astfel la o mai bună înțelegere a reglării epigenetice a activării genelor, precum și la dezvoltarea de medicamente care vizează HAT. La fel ca HAT-urile, HDAC-urile joacă un rol esențial în diverse procese celulare care implică histona H3 și H4. Până în prezent, au fost identificate cel puțin 4 clase de HDAC-uri. HDAC-urile din clasa I includ 1, 2, 3 și 8. HDAC-urile din clasa II sunt compuse din 4, 5, 6, 7, 9 și 10. Enzimele din clasa III, cunoscute sub numele de sirtuine, necesită cofactori NAD+ și includ SIRT-urile 1-7. Enzima de clasa IV, care conține doar HDAC11, are caracteristici atât ale clasei I, cât și ale clasei II. Inhibarea HDAC prezintă efecte semnificative asupra apoptozei, opririi ciclului celular și diferențierii în celulele canceroase. Inhibitorii HDAC sunt în prezent în curs de dezvoltare ca agenți anticancerigeni.2
Extrageți proteinele nucleare din proba care vă interesează, apoi utilizați o metodă de tip ELISA pentru a măsura cantitatea de proteine HDAC sau nivelurile de activitate ale HDAC sau nivelurile de activitate ale HAT.
Metilarea/demetilarea histonelor
Metilarea histonelor este definită ca fiind transferul uneia, a două sau a trei grupări metil de la S-adenozil-L-metionină la reziduurile de lizină sau arginină ale proteinelor histonice de către histone metiltransferazele (HMT). HMT-urile controlează sau reglează metilarea ADN-ului prin reprimarea sau activarea transcripțională dependentă de cromatină. În nucleul celular, atunci când are loc metilarea histonei, genele specifice din ADN complexate cu histona pot fi activate sau reduse la tăcere.3 Există mai multe histone metiltransferaze diferite care sunt specifice pentru reziduul de lizină sau arginină pe care îl modifică. În cazul histonei H3, de exemplu, SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx și SMYD3 sunt histone metiltransferaze care catalizează metilarea histonei H3 la nivelul lizinei 4 (H3-K4) în celulele mamiferelor. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 și Eu-HMTase sunt histone metiltransferaze care catalizează metilarea histonei H3 la nivelul lizinei 9 (H3-K9) în celulele mamiferelor. G9a și enzimele din grupul polycomb, cum ar fi EZH2, sunt histone metiltransferaze care catalizează metilarea histonei H3 la nivelul lizinei 27 (H3-K27) în celulele mamiferelor.4 Atât metilarea H3-K9, cât și cea a H3-K27 mediază formarea heterocromatinei și participă, de asemenea, la reducerea la tăcere a expresiei genice în locurile eucromatice. S-a constatat, de asemenea, că o metilare globală crescută a H3-K27 este implicată în unele procese patologice, cum ar fi progresia cancerului.
Pe de altă parte, metilarea cu arginină a histonelor H3 și H4 promovează activarea transcripțională și este mediată de o familie de proteine arginină metiltransferaze (PRMT). Există 9 tipuri de PRMT-uri întâlnite la om, dar numai 7 membri sunt raportate ca metilând histonele. Acestea pot media mono sau dimetilarea reziduurilor de arginină. Pe baza poziției de adăugare a grupului metil, PRMT-urile pot fi clasificate în tipul I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 și PRMT8) și tipul II (PRMT5 și PRMT7). S-a constatat că PRMT-urile de tip II sunt puternic implicate în boli precum cancerul.5 De exemplu, PRMT5 joacă un rol în reprimarea anumitor gene supresoare de tumori, cum ar fi supresoarele tumorale RB, în timp ce supraexprimarea PRMT7 este observată în cancerul de sân. Detectarea activității și inhibarea PRMT-urilor de tip II, precum și a altor HMT-uri ar fi importantă pentru elucidarea mecanismelor de reglare epigenetică a activării și reducerii la tăcere a genelor, precum și pentru diagnosticarea și terapia cancerului.
Începeți prin a izola proteinele histonice din probele de interes, apoi selectați un kit ELISA adecvat pentru a detecta nivelurile de metilare a histonelor.
Demetilarea histonelor este îndepărtarea grupărilor metil în proteinele histonice modificate prin intermediul demethylaselor histonice. S-a constatat că aceste demetilaze au potențiale funcții oncogene și implicare în alte procese patologice. Descoperirea demethylaselor histone demonstrează că metilarea histonei nu este o modificare permanentă, ci mai degrabă un proces mai dinamic. Au fost descoperite două familii majore de demethylases: Demetilaza 1 (LSD1) și histone demethylases care conțin domeniul Jumonji (domeniul JmjC) (JMJD2, JMJD3/UTX și JARIDs). Reziduul de aminoacid specific și gradul de metilare determină enzima de demetilare. De exemplu, pe histona H3, lizina 4 mono- și di-metilată este demetilată de LSD1 (BHC110, KDM1) și lizina 4 tri-metilată de JARID (1A-1D); Lizina 27 di- și tri-metilată este demetilată de JMJD3 și UTX (KDM6A), iar lizina 9 mono- și di-metilată este demetilată de JMJD1 și lizina 9 tri-metilată este demetilată de JMJD2.6 Inhibarea demetilazelor histonice poate duce la remetilarea histonică la nivelul unor reziduuri specifice importante pentru dinamica cromatinei și expresia genelor. În plus, detectarea activității și inhibarea acestor enzime ar fi importantă pentru elucidarea mecanismelor de reglare epigenetică a activării și reducerii la tăcere a genelor și ar putea fi benefică pentru diagnosticarea și terapia cancerului.
Extrageți proteinele nucleare din proba dvs. de interes, apoi implementați o tehnică bazată pe ELISA pentru a investiga activitatea și nivelurile de inhibiție ale demethylaselor histonice din familiile LSD1 și JmjC-domain.
Pregătiți să învățați despre un alt mecanism epigenetic? Citiți mai departe: ARN non-codificator
.
