Subjekt och avbildningsförfaranden
Experiment 1 (3,0 T): Tjugo friska vuxna (11 män, ålder 26,2 ± 3,1 år) gav informerat samtycke till att delta i experimentet. Uppgifterna om 16 deltagare har redan rapporterats i vår tidigare studie15. Fyra deltagare var nyrekryterade för den här studien. Uteslutningskriterierna omfattade betydande psykiatrisk eller neurologisk historia. Studien godkändes av University of Toronto Research Ethics Board (REB) och SickKids hospital REB. Inget statistiskt test utfördes för att fastställa urvalsstorleken på förhand. De urvalsstorlekar vi valde liknar dem som använts i tidigare publikationer16, 26. Experimentet genomfördes med hjälp av ett 3,0 T fMRI-system (Siemens Trio). Lokaliseringsbilder samlades först in för att rikta in synfältet (FOV) centrerat på varje deltagares hjärna. T1-viktade anatomiska bilder togs (1 mm3, 256 × 256 FOV; MPRAGE-sekvens) före de experimentella echoplanära avbildningarna (EPI). För funktionell avbildning användes en gradienteko-planär sekvens (repetitionstid (TR) = 2000 ms, ekotid (TE) = 27 ms, flipvinkel = 70°). Varje funktionell körning bestod av 263 förvärv av hela hjärnan (40 × 3,5 mm skivor, interleaved förvärv, FOV = 192 mm, matrisstorlek = 64 × 64, upplösning i plan 3 mm). De fyra första funktionella bilderna i varje körning uteslöts från analysen för att möjliggöra jämvikt av longitudinell magnetisering.
Experiment 2 (7,0 T): Elva friska vuxna (6 män, ålder 22,2 ± 2,2 år) gav informerat samtycke till att delta i experimentet. Studien godkändes av den etiska kommittén vid National Institute for Physiological Sciences of Japan. Inget statistiskt test utfördes för att på förhand bestämma urvalsstorleken. De urvalsstorlekar vi valde liknar dem som använts i tidigare publikationer16, 26. Experimentet genomfördes med hjälp av ett 7,0 T fMRI-system (Siemens Magnetom). Lokaliseringsbilder samlades först in för att justera FOV:et centrerat på varje deltagares hjärna. T1-viktade anatomiska bilder togs (0,75 mm isometrisk, 224 × 300 FOV; MPRAGE-sekvens). För funktionell avbildning användes en gradienteko-planär sekvens (TR = 500 ms, TE = 25 ms, flipvinkel = 35°, multibandfaktor = 4). Varje funktionell körning bestod av 1010 förvärv av hela hjärnan (32 × 2,0 mm skivor, interleaved förvärv, FOV = 208 mm, matrisstorlek = 104 × 104, upplösning i plan på 2 mm). De fyra första funktionella bilderna i varje körning uteslöts från analysen för att möjliggöra jämvikt av longitudinell magnetisering.
beteendeprocedurer
Experiment 1: Gustatoriska stimuli levererades genom plaströr som konvergerade till en plastfördelare, vars munstycke droppade smaklösningar i munnen. Rören var förfyllda så att nästan ingen fördröjning observerades mellan presentationen av den visuella stimulansen och vätskans avgivning. Hundra försök med smaklösningar randomiserades och balanserades i fem omgångar. I varje försök levererades 0,5 ml smaklösning under 1244 ms. När vätsketillförseln avslutades instruerades deltagarna på en skärm att svälja vätskan (1 s). Efter 7756 ms dök skalbalkar upp för att bedöma vätskans positivitet (3 s) och sedan negativitet (3 s). Detta följdes av 0,5 ml smaklös vätska under 1244 ms för sköljning, följt av 1 s sväljningsinstruktion. Efter ett intervall på 7756 ms mellan försöken inleddes nästa försök.
Experiment 2: I jämförelse med experiment 1 skiljde sig gustativa stimulusleveranser endast åt i fråga om timing och kvantitet. Hundra smaklösningsförsök randomiserades och balanserades över fem körningar. I varje försök levererades 0,88 ml smaklösning under 2 s. När vätskeleveransen avslutades instruerades deltagarna på en skärm att svälja vätskan (2 s). Efter 4 000 ms dök skalbalkar upp för att bedöma vätskans positivitet (3 s) och sedan negativitet (3 s). Detta följdes av 0,88 ml av den smaklösa vätskan under 2 s för sköljning, följt av instruktionen att svälja efter 2 s. Efter ett 7 s inter-trial-intervall inleddes nästa försök.
Pre-experimentell session
Experiment 1: För att ta hänsyn till individuella skillnader i deras subjektiva upplevelser av olika smaker ombads deltagarna att smaka på ett bredare spektrum av intensiteter (mätt som molärkoncentrationer) av de olika smaklösningarna (surt, salt, bittert och sött). Under detta förexperimentella moment testades deltagarna för 1 försök (2 mL) av var och en av de 16 smaklösningarna enligt följande: (1) surt/citronsyra: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M och 1,0 × 10-2 M, (2) salt/bordssalt: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M och 1,0 × 10-2 M, (2) salt/bordssalt: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M och 1,0 × 10-1 M, 3) bitter/kininsulfat: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M och 7,8 × 10-6 M, och 4) sött/sukros: Ordningen för presentationen randomiserades efter smak och sedan efter koncentration inom varje smak. Efter att ha druckit varje lösning sköljde och svalde deltagarna 5 ml vatten och bedömde sedan intensiteten och behagligheten (valensen) av upplevelsen av lösningen på separata skalor från 1-9. De koncentrationer för varje smak som matchade i intensitet valdes ut. Tidigare arbete2 hade visat att deltagarna har olika baslinjer för betygsättning och att de koncentrationer som valdes ut på det mest tillförlitliga sättet ligger över medelhög självrapporterad intensitet. Alla lösningar blandades med kemiska föreningar av farmaceutisk kvalitet från Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), säkra för konsumtion.
Experiment 2: Deltagarna testades för 1 försök (1 mL) av var och en av de 16 smaklösningarna enligt följande: (1) söt 1/glukos: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M och 0,38 M; (2) söt 2/sukralos: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M och 0,26 × 10-4 M; (3) bitter 1/catechin: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M och 4,4 × 10-3 M; (4) bitter 2/magnesiumklorid: Presentationsordningen randomiserades efter smak och sedan efter koncentration inom varje smak. Efter att ha druckit varje lösning sköljde och svalde deltagarna 5 ml vatten och bedömde sedan intensiteten och behagligheten (valensen) av upplevelsen av lösningen på separata skalor från 1-9. De koncentrationer för varje smak som matchade i intensitet valdes ut. Alla lösningar blandades med kemiska föreningar av livsmedelskvalitet från DHC (katekin), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (magnesiumklorid), Tsuruya Chemical Industries (sukralos) och Nichiga (glukos).
Dataanalys
Data analyserades med hjälp av programvaran SPM8 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Funktionella bilder omjusterades, skivtidskorrigerades och normaliserades till MNI-mallen (ICBM 152) med interpolering till ett utrymme på 2 × 2 × 2 × 2 mm. Data utjämnades rumsligt (full bredd, halvmaximum (FWHM) = 6 mm) för univariat parametrisk moduleringsanalys men inte för multivoxelmönsteranalys eftersom det kan försämra prestandan19. Varje stimuluspresentation modellerades som en separat händelse med hjälp av den kanoniska funktionen i SPM8. För varje voxel minskades t-värdena för enskilda försök genom att subtrahera medelvärdet över försöken. För att visualisera avbildningsresultaten användes freesurfer-programvaran39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) och SPM surfrend toolbox (skriven av I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) efter modifiering.
Univariabel analys
Vi utförde univariata analyser för att undersöka om grundsmaker kodades av specifika voxlar i insula. Regressorer som kodade varje smakämne var tidsbundna till stimuluspresentation. Univariella analyser genomfördes två gånger: med och utan regressorer för hedonisk valens (fig. 1). För att visualisera hur mycket varians som kunde förklaras av hedoniska valensregressorer i de bitterkänsliga regionerna valde vi ut signifikanta voxlar i kontrasten ”bitter vs. smaklös” utan valensregressorer (kompletterande figur 1). Genomsnittlig aktivitet visades för aktivitet mot vilande baslinje (kompletterande figur 1a), aktivitet mot smaklös (kompletterande figur 1b) och aktivitet mot smaklös med valens regresserad ut (kompletterande figur 1c). För att testa förekomsten av voxelspecifik smakinställning delade vi upp varje deltagares udda och jämna körningar och jämförde voxelaktiviteten för varje smak i de udda körningarna med voxelaktiviteten för varje smak i de jämna körningarna. När voxlar rangordnades utifrån aktivering för varje smak i jämna körningar fann vi konsekventa mönster av motsvarande minskande aktivering för alla fyra smakerna i udda körningar (fig. 1b, kompletterande figur 4). Korrelationer beräknades för voxelaktivering mellan udda och jämna körningar mellan alla smakkombinationer inom varje deltagare, som underkastades ett t-test med ett stickprov mellan deltagarna (fig. 1c, fig. 4a, b). Vi beräknade vidare korrelationer mellan udda och jämna körningar för alla kombinationer med samma smak och olika smaker inom varje deltagare. Korrelationskoefficienter z-transformerades och underkastades ett t-test med ett stickprov mellan deltagarna (fig. 1d, fig. 4b, d).
Sökljusanalys för smak-typrepresentationer
Vi analyserade fMRI-data från den insulära hjärnbarken med hjälp av sökljusanalys (radie på 4 mm, inklusive 33 voxlar)20. Inom en given sfär för varje deltagare skapades en vektor som innehöll det rumsliga mönstret av BOLD-MRI-signalen tidslåst till stimuluspresentation (normaliserade t-värden per voxel). För att utvärdera om aktivitetsmönstren i strålkastarsfärerna kan särskilja smaktyper använde vi oss av en korsvalidering med bortlämnande av ett stimulus-par-ut-korsvalidering40. I detta förfarande tränades LDA-klassificatorn på 38 försök, som innehöll den testade smaktypen och en annan smaktyp (19 försök för vardera) och testades sedan på det utelämnade stimulusparet. Klassificeringsprestanda för varje smak genomsnittades över jämförelser med andra smaker (t.ex. klassificeringsprestanda för sura smaker genomsnittades över sura jämfört med söta, sura jämfört med bittra, sura jämfört med salta och sura jämfört med smaklösa smaker). På individnivå motsvarade 58,7 % klassificeringsnoggrannhet p < 0,05 okorrigerat. För gruppanalysen jämnades de individuella kartorna över klassificeringsprestanda ut med en Gaussisk kärna med 4 mm FWHM och utsattes sedan för ett permutationstest med ett stickprov med hjälp av SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). I detta förfarande vändes data från varje deltagare slumpmässigt genom att multiplicera – 1 efter att ha subtraherat 50 % (noggrannhet på slumpnivå) och sedan utsättas för ett t-test med ett stickprov mellan deltagarna. Detta permuterades 10 000 gånger, vilket resulterade i fördelningen av maximalt t inom insula. Baserat på denna fördelning bestämdes tröskelvärdet för 5 % FWE.
Smakkonjunktionsanalys
För multi-smakkonjunktionsanalys (fig. 2b) testades varje voxel på om den överskred tröskelvärdet för de fyra smaktypdiskrimineringarna där varje smaktypdiskriminering genomsnittligt beräknade klassificeringsprestationen över fyra jämförelser (t.ex. surt vs. sött, surt vs. bittert, surt vs. salt och surt vs. smaklöst), vilket översteg slumpmässig klassificering (50 %). En giltig konjunkturavledning kräver signifikanta resultat för alla jämförelser41. Vi räknade alltså antalet smaktyper som uppfyllde 5 % FWE-tröskelvärde i varje voxel inom insula.
Smakparanalys
För analys av specifika smakpar undersökte vi en oberoende definierad ROI inom insula. Först använde vi ett förfarande där vi uteslöt en enda försöksperson och exkluderade var och en av 20 försökspersoner, för att sedan beräkna en karta över 4-smakskonjunktioner (dvs. voxlar som uppfyller alla 4 smakkontraster som beskrivs ovan) med de återstående 19 försökspersonerna, vilket resulterade i 20 kartor. Överlappningen av dessa 20 gruppkartor visas i figur 2c. De voxlar från kartan som uppfyller tröskelvärdet för 5 % FWE definierades som den ROI som kan göra smakdiskriminering. Inom denna ROI undersökte vi diskrimineringen av specifika smakpar genom att beräkna klassificeringsprestanda för varje smakpar. Gruppens prestanda beräknades som den genomsnittliga klassificeringsprestandan hos 20 försökspersoner (fig. 2d).
För smakpardiskriminering baserad på värderingar av valens (fig. 2e) utförde vi en LDA-analys med hjälp av försökspersonernas värderingar av valens (dvs. oberoende av fMRI-data). Valens beräknades genom att subtrahera negativitetsbetyg från positivitetsbetyg för varje försök. Smakklassificering beräknades med hjälp av en leave-one-trial-out tränad på de 19 återstående försöken för varje smaktyp.
Valens- och smaktypsanalys
För att testa smaktypens oberoende av valens undersökte vi likheten mellan fMRI-data inom den ROI som definierades av konjunktionskartan med fyra smaker ovan. För varje försöksperson beräknades korrelationer försök för försök, vilket resulterade i 4950 (100 × 99/2) korrelationskoefficienter, sorterade i 2 × 2 kategorier av smaktyp (samma, olika) × hedonisk valens (samma, olika). Korrelationskoefficienterna genomsnittsberäknades inom varje cell per försöksperson, sedan utsattes alla försökspersoners data för en tvåvägs ANOVA med upprepade åtgärder med smaktyp och valens som faktorer (fig. 2g).
Vi utförde vidare en uppföljande analys utan databeroende i korrelationerna från försök till försök över de 2 × 2 cellerna. Vi befolkade slumpmässigt varje cell med de 100 försöken och upprepade denna procedur 1 000 000 gånger. Från dessa analyserade vi permutationen med störst kongruens mellan 2 × 2-faktorerna och de faktiska försökskategorierna (baserat på det maximala geometriska medelvärdet av andelen reducerade data över de fyra cellerna). Vi beräknade sedan korrelationer mellan försök endast inom varje cell, vilket säkerställde att det inte fanns något beroende mellan cellerna. Korrelationskoefficienterna medelvärdesberäknades inom varje cell per försöksperson, varefter alla återstående försökspersoners data underkastades en tvåvägs ANOVA med upprepade åtgärder (kompletterande figur 3).
Smak-typmönster skiljde sig åt oberoende av smakvalens, dvs. smakdiskrimineringskartor var åtskiljbara från smaklighet. På grund av det starka sambandet mellan smaktyp och valens var försökskombinationer inte lika på alla nivåer. Till exempel var samma valens med olika smaktyper relativt sällsynta (kompletterande tabell 4). Detta tyder dock inte på multikollinearitet i effektstorleken.
Statistik
Vi analyserade data utan att anta normalfördelning, med hjälp av icke-parametrisk statistik. Före ANOVA (fig. 2g) genomfördes Levenes test för att säkerställa att antagandet om homoscedasticitet var uppfyllt. Korrigeringar för multipla jämförelser tillämpades med hjälp av Bonferroni-korrigering.
Rapporteringssammanfattning
Fördjupad information om den experimentella utformningen finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till den här artikeln.
