En histonmodifikation är en kovalent posttranslationell modifiering (PTM) av histonproteiner som omfattar metylering, fosforylering, acetylering, ubiquitylering och sumoylering. De PTM:er som görs på histoner kan påverka genuttrycket genom att förändra kromatinstrukturen eller rekrytera histonmodifierare. Histonproteiner fungerar för att packa in DNA, som är lindat runt de åtta histonerna, i kromosomerna. Histonmodifieringar verkar i olika biologiska processer, t.ex. transkriptionsaktivering/inaktivering, kromosomförpackning och DNA-skada/reparation. Hos de flesta arter är histon H3 främst acetylerat vid lysinerna 9, 14, 18, 23 och 56, metylerat vid arginin 2 och lysinerna 4, 9, 27, 36 och 79 samt fosforylerat vid ser10, ser28, Thr3 och Thr11. Histon H4 är huvudsakligen acetylerat vid lysinerna 5, 8, 12 och 16, metylerat vid arginin 3 och lysin 20 samt fosforylerat vid serin 1. Kvantitativ detektion av olika histonmodifieringar skulle således ge användbar information för en bättre förståelse av epigenetisk reglering av cellulära processer och utveckling av histonmodifierande enzymriktade läkemedel.
Histonacetylering/Deacetylering
Histonacetylering sker genom enzymatisk tillsats av en acetylgrupp (COCH3) från acetylcoenzym A. Histonacetyleringsprocessen är nära involverad i regleringen av många cellulära processer, inklusive kromatindynamik och transkription, tystnad av gener, cellcykelutveckling, apoptos, differentiering, DNA-replikation, DNA-reparation, nukleär import och neuronal repression. De modifierande enzymer som är involverade i histonacetylering kallas histonacetyltransferaser (HAT) och spelar en viktig roll i kontrollen av histon H3- och H4-acetylering. Mer än 20 HATs har identifierats och kan klassificeras i fem familjer: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP och kärnreceptorcoaktivatorer som ACTR.1 Histon H3-acetylering kan ökas genom hämning av histondeacetylaser (HDAC) och minskas genom hämning av HAT.
Histondeacetylaster (HDAC) katalyserar det hydrolytiska avlägsnandet av acetylgrupper från histonlysinrester. En obalans i jämvikten av histonacetylering har förknippats med tumörigenes och cancerutveckling. Att upptäcka om histon H3 är acetylerat vid sina lysinrester skulle ge användbar information för ytterligare karakterisering av acetyleringsmönster eller acetyleringsställen, vilket skulle leda till en bättre förståelse av epigenetisk reglering av genaktivering samt till utveckling av HAT-målinriktade läkemedel. I likhet med HATs spelar HDACs en kritisk roll i olika cellulära processer som involverar histon H3 och H4. Hittills har minst fyra klasser av HDAC identifierats. Klass I HDACs omfattar 1, 2, 3 och 8. Klass II HDACs består av 4, 5, 6, 7, 9 och 10. Enzymer i klass III, som kallas sirtuiner, kräver NAD+-kofaktorer och omfattar SIRT 1-7. Klass IV-enzymet, som endast innehåller HDAC11, har egenskaper från både klass I och II. HDAC-hämning uppvisar betydande effekter på apoptos, cellcykelstopp och differentiering i cancerceller. HDAC-hämmare utvecklas för närvarande som medel mot cancer.2
Extrahera dina nukleära proteiner från ditt prov av intresse och använd sedan en ELISA-liknande metod för att mäta mängden HDAC-proteiner, eller aktivitetsnivåerna av HDAC eller aktivitetsnivåerna av HAT.
Histonmetylering/Demetylering
Histonmetylering definieras som överföringen av en, två eller tre metylgrupper från S-adenosyl-L-methionin till lysin- eller argininrester av histonproteiner av histonmetyltransferaser (HMT). HMTs kontrollerar eller reglerar DNA-metylering genom kromatinberoende transkriptionell repression eller aktivering. När histonmetylering sker i cellkärnan kan specifika gener i det DNA som är sammansatt med histonet aktiveras eller tystas.3 Det finns flera olika histonmetyltransferaser som är specifika för den lysin- eller arginininrest som de modifierar. På histon H3 är till exempel SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx och SMYD3 histonmetyltransferaser som katalyserar metylering av histon H3 vid lysin 4 (H3-K4) i däggdjursceller. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 och Eu-HMTase är histonmetyltransferaser som katalyserar metylering av histon H3 vid lysin 9 (H3-K9) i däggdjursceller. G9a och enzymer från polycombgruppen, t.ex. EZH2, är histonmetyltransferaser som katalyserar metylering av histon H3 vid lysin 27 (H3-K27) i däggdjursceller.4 Metylering av både H3-K9 och H3-K27 medierar bildandet av heterokromatin och deltar också i tystandet av genuttrycket vid euchromatiska platser. Ökad global H3-K27-metylering har också visat sig vara involverad i vissa patologiska processer såsom cancerprogress.
Å andra sidan främjar argininmetylering av histonerna H3 och H4 transkriptionsaktivering och medieras av en familj av protein arginininmetyltransferaser (PRMTs). Det finns 9 typer av PRMTs som finns hos människor, men endast 7 medlemmar rapporteras metylera histoner. De kan förmedla mono- eller dimetylering av argininrester. Baserat på positionen för metylgruppstillägget kan PRMTs klassificeras i typ I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 och PRMT8) och typ II (PRMT5 och PRMT7). PRMTs av typ II har visat sig vara starkt involverade i sjukdomar som cancer.5 PRMT5 spelar till exempel en roll i repressionen av vissa tumörsuppressorgener, t.ex. RB-tumörsuppressorgener, medan PRMT7 överuttryck observeras vid bröstcancer. Detektion av aktivitet och hämning av PRMTs av typ II samt andra HMTs skulle vara viktigt för att belysa mekanismerna för epigenetisk reglering av genaktivering och tystnad samt för att gynna cancerdiagnostik och -terapi.
Start med att isolera dina histonproteiner från dina prover av intresse, välj sedan ett lämpligt ELISA-kit för att detektera histonmetyleringsnivåer.
Histondemetylering är avlägsnandet av metylgrupper i modifierade histonproteiner via histondemetylaser. Dessa demetylaser har visat sig ha potentiella onkogena funktioner och inblandning i andra patologiska processer. Upptäckten av histondemetylaser visar att histonmetylering inte är en permanent modifiering utan snarare en mer dynamisk process. Två stora familjer av demetylaser har upptäckts: Lysinspecifikt demetylas 1 (LSD1) och histondemetylaser som innehåller Jumonji-domäner (JmjC-domäner) (JMJD2, JMJD3/UTX och JARIDs). Den specifika aminosyraresten och metyleringsgraden bestämmer demetyleringsenzymet. På histon H3 demetyleras till exempel mono- och di-metylerat lysin 4 av LSD1 (BHC110, KDM1) och tri-metylerat lysin 4 av JARID (1A-1D); di- och trimetylerat lysin 27 demetyleras av JMJD3 och UTX (KDM6A) och mono- och dimetylerat lysin 9 demetyleras av JMJD1 och trimetylerat lysin 9 demetyleras av JMJD2.6 Hämning av histondemetylaser kan leda till histonremetylering vid specifika rester som är viktiga för kromatindynamiken och genuttrycket. Dessutom skulle det vara viktigt att upptäcka aktivitet och hämning av dessa enzymer för att belysa mekanismerna för epigenetisk reglering av genaktivering och tystnad, vilket skulle kunna gynna cancerdiagnostik och -terapi.
Extrahera dina kärnproteiner från ditt prov av intresse och använd sedan en ELISA-baserad teknik för att undersöka aktivitets- och inhiberingsnivåer för histondemetylaser av LSD1- och JmjC-domänfamiljerna.
Är du redo att lära dig mer om en annan epigenetisk mekanism? Läs vidare: Icke-kodande RNA
