Beyond COX-1: the effects of aspirin on platelet biology and potential mechanisms of chemoprevention

Płytki krwi odgrywają krytyczną rolę w hemostazie, zakrzepicy i utrzymaniu integralności naczyń krwionośnych. Niewłaściwa regulacja aktywności płytek krwi może prowadzić do nieprawidłowego krwawienia, natomiast nadmierna aktywność prowadzi do zakrzepicy i ostrych incydentów niedokrwiennych. Proces krzepnięcia jest regulowany przez glikoproteiny powierzchni błony oraz receptory, które uruchamiają kaskadę krzepnięcia po związaniu z egzogennymi efektorami, takimi jak adenozyno-difosforan (ADP), tromboksan A2 (TXA2), serotonina, kolagen, trombina i epinefryna. Podstawowa sekwencja w agregacji płytek krwi przebiega w trzech etapach: inicjacji, rozszerzenia i stabilizacji. Na etapie inicjacji płytki krwi wiążą się z kompleksami czynnika von Willebranda (vWF)/kolagenu i pozostają w miejscu uszkodzenia naczynia i odpowiedzi na nie wystarczająco długo, aby wywołać dalszą aktywację przez kolagen. Amplifikacja charakteryzuje się drugą falą wydzielania i agregacji i jest dodatkowo wzmocniona przez uwalnianie przez płytki krwi trombiny, adenozynodifosforanu (ADP) i tromboksanu A2 (TXA2). Druga fala wyznacza również fazę rozszerzenia, w której nowo przybyłe płytki przylegają do początkowej monowarstwy płytek. Po interakcji receptor białkowy-efektor, aktywowane płytki kontynuują agregację tworząc mostki pomiędzy glikoproteinami powierzchniowymi, fibrynogenem, fibryną i vWF do aktywowanych glikoprotein. Ta faza stabilizacji obejmuje kolejne zdarzenia sygnalizacyjne w formacji wtyczki płytkowej, która umożliwia konsolidację agregatu płytek, aby zapobiec ich rozproszeniu przez siły ścinające w krwi krążącej.

Sygnalizacja w agregacji płytek rozpoczyna się od aktywacji receptorów na powierzchni płytek przez agonistów, takich jak kolagen, trombina, ADP, TXA2 i epinefryna. Aktywacja tych receptorów GPCR prowadzi do aktywacji fosfolipazy A2, która rozszczepia fosfotydylocholinę i inne fosfolipidy błonowe, uwalniając arachidonian z pozycji C2 szkieletu glicerolu. Arachidonian może być przekształcony w szereg prostaglandyn (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2α,), które pośredniczą w odpowiedzi prozapalnej. Ponadto tromboksany, takie jak TXA2, indukują uwalnianie płytek krwi, agregację i krzepnięcie, a także wzmacniają aktywację krążących płytek. Syntaza endoperoksydazy prostaglandynowej-1 (PGSH-1)/cyklooxygenaza-1 (COX-1) przeprowadza początkowe reakcje cyklooksygenazy i peroksydazy w celu przekształcenia kwasu arachidonowego w prekursorowe metabolity, prostaglandynę G2 i prostaglandynę H2. Te z kolei są chemicznie przetwarzane w inne prostaglandyny, w tym TXA2, która pośredniczy w większości odpowiedzi płytkowej. Podsumowanie zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących podczas aktywacji płytek krwi przedstawiono na ryc. 3.

Aspiryna moduluje aktywność i biologię płytek krwi – hamowanie cyklooksygenazy

Aspiryna hamuje agregację płytek krwi i uwalnianie prostaglandyn . Wczesne badania z użyciem aspiryny znakowanej radiolabidem 14C przy węglu karbonylu octanu wykazały, że <0,1% radiolabium 14C zostało pobrane przez płytki krwi i że aktywność ta była związana głównie z trzema białkami. Chociaż asocjacja była nieodwracalna, wskazując na tworzenie wiązania kowalencyjnego, stwierdzono, że jest ona nasycalna tylko w biologicznie istotnych stężeniach dla pojedynczego białka o masie 85 kDa. Pozostałe dwa rozpuszczalne białka płytek krwi wykazywały nienasyconą acetylację, co sugeruje, że acetylacja zależna od aspiryny w płytkach krwi jest zarówno specyficzna, jak i niespecyficzna. Później okazało się, że acetylowany enzym o masie 85 kDa to syntaza endoperoksydów prostaglandyn-1 (PTGS-1/COX-1). Hamowanie płytkowej COX-1 przez acetylotransferazę jest nieodwracalne, a inhibicja utrzymuje się przez cały 10-dniowy okres życia płytki.

COX-1 jest dwufunkcyjnym enzymem konstytutywnie wyrażanym w większości tkanek i przeprowadza dwie różne i sekwencyjne reakcje w przestrzennie odrębnych, ale mechanistycznie sprzężonych miejscach aktywnych. W prawidłowych komórkach COX-1 jest związany z błoną i osadzony w luminalnej powierzchni retikulum endoplazmatycznego, jak również w wewnętrznej i zewnętrznej powierzchni otoczki jądrowej. Płytki krwi s± jednak anukleatycznymi fragmentami komórek i wykazuj± ekspresję białka COX-1 w gęstym systemie błon kanalikowych, który powstaje z systemu błon demarkacyjnych podczas biogenezy płytek. Ten gęsty rurkowaty system błonowy odgrywa ważną rolę w aktywacji płytek krwi i jest głównym miejscem syntezy eikozanoidów w płytkach krwi. Homodimer COX-1 o masie 85 kDa zawiera 576 reszt i jest glikozylowany na różnych łańcuchach bocznych lizyny. Chociaż COX-1 jest jednym z niewielu białek, które zostały powiązane z inhibicją aspiryny w jej miejscu aktywnym, ważne jest, aby zauważyć, że glikozylacja reszt lizynowych zwiększa acetylację innych reszt, a w tym przypadku seryny w miejscu aktywnym COX-1. Każda podjednostka strukturalna COX-1 zawiera trzy domeny składowe: domenę naskórkowego czynnika wzrostu, domenę wiążącą błonę oraz katalityczne miejsce aktywne. Domena katalityczna zawiera miejsce cyklooksygenazy, która przeprowadza dwuetylenowanie kwasu arachidonowego, tworząc endoperoksyd hydroksylowy – prostaglandynę G2 (PGG2), podczas gdy sąsiadujące z nią miejsce aktywne peroksydazy przeprowadza redukcję PGG2 do PGH2. Naprzeciwko membranowej domeny aktywnej, w obrębie domeny katalitycznej, znajduje się miejsce aktywne peroksydazy, które posiada kofaktor hemowy związany w płytkiej szczelinie. Grupa hemowa jest niezbędna do aktywacji rodnika tyrozylowego w miejscu aktywnym cyklooksygenazy do peroksydacji lipidów kwasu arachidonowego. Naprzeciwko miejsca peroksydazy wiążącego hem, na szczycie tunelu pochodzącego z domeny wiążącej błony, znajduje się miejsce aktywne cyklooksygenazy. Kwas arachidonowy wi±że się w tym miejscu, powoduj±c repozycjonowanie karboksylanu substratu do di-oksygenacji. Badania strukturalne owczej COX-1 traktowanej kwasem 2-bromoacetoksy benzoesowym sugerują, że wiązanie kwasu arachidonowego do końca cyklooksygenazy w miejscu aktywnym, a w konsekwencji podwójne utlenianie kwasu arachidonowego, są hamowane w wyniku acetylacji seryny 530 .

Odwracalne hamowanie COX-1 przez aspirynę acetylacja seryny miejsca aktywnego dramatycznie zmniejsza biosyntezę prostaglandyn. W płytkach krwi COX-1 nie może być szybko regenerowany, a w konsekwencji aktywność COX-1 może być przywrócona jedynie poprzez nową biogenezę płytek krwi. Synteza tromboksanu A2, prostaglandyny E2 i prostacykliny (PGI2) jest najsilniej zaburzona w płytkach krwi poddanych działaniu aspiryny, co powoduje upośledzenie mechanizmu krzepnięcia, zmniejszenie wydzielania błony śluzowej żołądka, zwiększone drażnienie przez kwasy żołądkowe, a także zmienione patofizjologiczne krzepnięcie i rozszerzenie/zwężenie naczyń krwionośnych .

COX-2 jest w 60% identyczna z COX-1 na poziomie aminokwasów, a ich trójwymiarowe struktury są prawie nakładalne. COX-2 jest indukowalna, a jej ekspresję zwiększają te same prostaglandyny, które są syntetyzowane przez COX-1 w płytkach krwi i komórkach nabłonkowych. COX-2 ulega nadekspresji podczas megakariocytopoezy i została zidentyfikowana w przekrojowych próbkach szpiku kostnego od pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową i rumieniem wielopostaciowym (polycythemia vera). W innym badaniu scharakteryzowano poziom ekspresji COX-2 w płytkach krwi w stosunku do COX-1, poprzez bezpośredni pomiar poziomu mRNA. Stwierdzono, że płytki krwi wykazują ekspresję COX-2 na poziomie porównywalnym do niektórych złośliwych komórek nabłonkowych, aczkolwiek na znacznie niższym poziomie niż płytkowa COX-1. Acetylacja COX-2 w komórkach śródbłonka i nabłonka hamuje biosyntezę PGI2 i PGE2, które wywierają różny wpływ na dalsze procesy, takie jak zapalenie. Chociaż hamowanie COX-1 i COX-2 przez aspirynę powoduje odmienne profile hamowania biosyntezy prostaglandyn, podstawą hamowania w obu przypadkach jest blokada syntazy endoperoksydów prostaglandyn i w konsekwencji zmniejszenie stężenia wielofunkcyjnej prostaglandyny H2. Rola COX-3 w kontekście biologii płytek krwi pozostaje nieznana.

Aktywność hamująca COX aspiryny jest zależna od podawanej dawki. Niskie dawki, w zakresie od 75 do 300 mg, powodują selektywne hamowanie wytwarzania TXA2 przez płytki krwi bez hamowania prostacykliny (PGI2), wspólnego antagonisty płytek krwi i czynnika rozszerzającego naczynia. Oczekuje się, że PGI2 pochodzi głównie z naczyniowej COX-2, co sugeruje, że hamowanie COX-2 jest minimalne w przypadku stosowania małych dawek. Większe dawki (>1200 mg) mają właściwości przeciwbólowe i przeciwzapalne, właściwości związane z patofizjologicznym hamowaniem COX-1 i COX-2. Należy zauważyć, że COX-2 może również wykorzystywać kwas arachidonowy do syntezy lipoksyn, zwłaszcza kwasu 15-hydroksyeikozatetraenowego (15-HETE). Oczekuje się, że ten szlak biosyntezy pozostanie nienaruszony nawet po acetylacji COX-2. To zróżnicowane hamowanie aktywności COX można częściowo wyjaśnić względną siłą hamującą aspiryny. Chociaż aspiryna jest zwykle uważana za niespecyficzny inhibitor COX, jest ona wysoce selektywna dla COX-1 w porównaniu z COX-2. Jak widać w pracy Blanco i wsp. , IC50 aspiryny dla COX-1 wynosi około 3,5 μM, podczas gdy IC50 dla COX-2 wynosi około 30 μM. Podczas gdy miejsca aktywne obu enzymów reagujące na aspirynę są homologiczne, acetylacja Ser-516 COX-2 powoduje tylko częściowe zahamowanie aktywności katalitycznej. Biorąc pod uwagę osiągalne stężenie w surowicy w reżimie niskich dawek (~7 μM), jest mało prawdopodobne, że COX-2 jest acetylowany w więcej niż 5%, podczas gdy COX-1 pochodzący z płytek krwi jest prawdopodobnie acetylowany w >70%. Sugeruje to, że regularne stosowanie aspiryny w małych dawkach będzie niezmiennie utrzymywać hamowanie COX-1 w krążących płytkach krwi, z minimalnym efektem hamowania obwodowej COX-2. Podsumowanie wpływu aspiryny w małych i dużych dawkach na aktywność COX we krwi i tkankach przedstawiono w tabeli 1.

Zależna od aspiryny acetylacja białek oddziałujących z płytkami krwi

Płytki krwi wykazują ekspresję różnych receptorów powierzchniowych, które umożliwiają im oddziaływanie z białkami osocza i krwi, patogenami, produktami związanymi z patogenami oraz śródbłonkiem objętym stanem zapalnym. Receptory powierzchniowe są krytyczne dla adhezji płytek krwi do uszkodzonego naczynia, formowania skrzepliny i aktywacji poprzez szereg efektorów metabolicznych. Interakcja pomiędzy płytkami krwi a innymi białkami krwi w krążeniu systemowym jest krytyczna dla wykonania i rozwiązania reakcji krzepnięcia. Co ciekawe, wiele z tych białek jest również modyfikowanych przez aspirynę.

Fibrynogen

Farr i współpracownicy zidentyfikowali fibrynogen w 1968 roku jako cel acetylacji aspiryny. Fibrynogen występuje jako białko rozpuszczalne w osoczu, jak również jako białko związane z błoną wewnątrzkomórkową w płytkach krwi. Fibrynogen stanowi 3-10% całkowitej ilości białka płytek krwi (przy czym blisko 25% znajduje się w α-granulkach) i jest uwalniany po aktywacji płytek. Stwierdzono, że fibrynogen jest acetylowany in vitro i in vivo przez aspirynę, tworząc pochodne ε-N-acetylo lizyny, przy czym średnio trzy reszty fibrynogenu ulegają modyfikacji. Acetylowany fibrynogen zwiększa podatność skrzepów fibryny na lizę .

Albumina

Modyfikacja albuminy przez acetylację aspiryną jest znana od ponad pół wieku . W wielu badaniach Farr i współpracownicy oceniali możliwe efekty konformacyjne wywołane przez dodanie grupy acetylowej do albuminy. Najczęściej omawiana w literaturze modyfikacja albuminy surowicy koncentruje się na acetylacji reszt lizynowych. Zaobserwowano również, że albumina surowicy ludzkiej wpływa na mechanizmy krzepnięcia płytek krwi poprzez wpływ na regulację wapnia.

Hemoglobina

Prawdopodobnie najważniejszy składnik środowiska krwi i osocza, hemoglobina, ulega acetylacji zależnej od aspiryny w warunkach in vitro i przypuszcza się, że ulega podobnym modyfikacjom przy wysokich dawkach aspiryny w warunkach in vivo. Badania acetylacji hemoglobiny przez aspirynę wykazały zmniejszenie glikacji białek, a w obecności wysokiego stężenia glukozy acetylacja hemoglobiny przez aspirynę jest zwiększona, efekt ten zaobserwowano również w albuminie surowicy. Aspiryna jest w stanie acetylować różne reszty lizyny w łańcuchach α i β hemoglobiny, bez wpływu na jej konformację strukturalną lub funkcje wiązania tlenu i transportu. Hemoglobina jest w stanie wywołać agregację płytek krwi poprzez interakcje z GP1βα, jednym z wielu białek receptorowych powierzchni płytek krwi. Stosunkowo niskie stężenia hemoglobiny są również zdolne do wywoływania agregacji płytek krwi, chociaż wpływ acetylacji hemoglobiny przez aspirynę na interakcje między hemoglobiną a płytkami krwi pozostaje nieznany.

Effect of aspirin on the platelet releasate: implications for cancer

Zahamowanie cyklooksygenazy i jednoczesne zmniejszenie biosyntezy tromboksanu skutkuje zmniejszeniem agregacji płytek krwi, ekspresji selektyny P i osłabieniem funkcji krzepnięcia. Poza rolą w modulowaniu agregacji płytek krwi, aspiryna zmienia również profil ekspresji i wydzielania białek w płytkach krwi. Wiele z tych białek bierze udział w pośredniczeniu w odpowiedzi na krzepnięcie i rekrutacji komórek odpornościowych do miejsca urazu. Jednak wiele białek znajdujących się w płytkowym „releasate” może również odgrywać ważną rolę w promowaniu angiogenezy i wzrostu guza.

Wykazano, że aspiryna hamuje uwalnianie interleukiny 7 (IL-7) przez płytki krwi stymulowane peptydem aktywującym receptor trombiny (SFLLRN). Zdrowi pacjenci przyjmujący aspirynę wykazywali również znacząco niższe stężenie IL-7 w osoczu. Wykazano, że ta prozapalna cytokina odgrywa kluczową rolę zarówno w dojrzewaniu komórek B, jak i komórek T. Wykazano również, że IL-7 odgrywa kluczową rolę w dojrzewaniu komórek T. Wykazano również, że IL-7 ma działanie zarówno pro-, jak i przeciwnowotworowe, przy czym to drugie wynika głównie z hamowania apoptozy poprzez regulację BCL2. Płytki krwi są również źródłem czynników proangiogennych, w tym VEGF i angiopoetyny-1 i istnieją pewne dowody sugerujące, że regularne stosowanie aspiryny zmniejsza stężenie obu czynników w osoczu, chociaż nie jest jasne, czy jest to wyłącznie funkcja uwalniania płytek krwi. Jest to poparte badaniem klinicznym, w którym terapia aspiryną wydawała się sprzyjać ogólnej równowadze antyangiogennej u kobiet z rakiem piersi, które otrzymywały tamoksyfen, co oceniano na podstawie obniżenia poziomu VEGF w osoczu i pośredniczonego przez receptor trombiny uwalniania TSP-1 i VEGF z płytek krwi.

Coppinger i wsp. przeprowadzili badanie proteomiczne oparte na spektrometrii masowej, aby dokładniej zbadać skład uwalnianego z płytek krwi w funkcji leczenia aspiryną. W tym badaniu, leczenie ludzkich płytek krwi aspiryną w małej dawce (20 μM) po stymulacji kolagenem, SFLLRN, lub ADP spowodowało znaczny spadek ilości białka znajdującego się w releasacie, chociaż stopień tej redukcji zależał od zastosowanego agonisty. Stwierdzono również, że leczenie aspiryną spowodowało obniżenie poziomu czynnika wzrostu regulującego wzrost (GRO), płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF), angiogeniny, RANTES i onkostatyny M (OSM) w releasacie płytek krwi, szczególnie po stymulacji kolagenem. Podczas gdy te, oraz inne cytokiny pochodzące z płytek krwi (np, CXCL4 i CTGF ), są krytyczne dla regulacji naprawy naczyń, odgrywają również rolę w napędzaniu nowotworzenia, angiogenezy i przerzutowania.

Definiowanie acetylomu aspiryny

Jak stwierdzono powyżej, aspiryna jest znana z acetylacji szerokiej gamy wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych celów białkowych, szczególnie w łańcuchu bocznym i N-końcowych grupach aminowych. Niestety, do tej pory nie przeprowadzono kompleksowych badań proteomicznych, które w sposób szczególny dotyczyłyby kwestii, które białka płytek krwi, poza enzymami COX, są acetylowane przez aspirynę lub biologicznej roli tych niekanonicznych acetylacji. W tej sekcji rozważymy poprzednie badania proteomiczne w celu identyfikacji niekanonicznych celów acetylacji mediowanej przez aspirynę i spróbujemy odnieść je do obecnego stanu proteomiki płytek krwi.

Były liczne badania proteomiczne, które próbowały określić zestaw białek acetylowanych przez fizjologiczne stężenia aspiryny w różnych liniach komórkowych. Bhat i współpracownicy zidentyfikowali 33 białka komórkowe acetylowane przez aspirynę po wzbogaceniu przeciwciałem anty-acetylo lizynowym. Późniejsza analiza za pomocą spektrometrii masowej zidentyfikowała obecność acetylowanych enzymów cytoszkieletowych i metabolicznych, w tym dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD), dehydrogenazy mleczanowej, enolazy, kinazy pirogronianowej i transketolazy, chociaż tylko G6PD została znacząco zahamowana przez acetylację wywołaną aspiryną in vitro. Sugeruje to, że aspiryna może blokować przepływ przez szlak pentozowo-fosforanowy, choć konieczne są dodatkowe badania, aby to potwierdzić. Grupa ta wykazała również, że aspiryna acetyluje p53, co skutkuje zwiększonym wiązaniem DNA, ekspresją p21Cip i nasileniem apoptotycznej śmierci komórek w obecności kamptotecyny. Podczas gdy efekty te zostały wykazane w wielu liniach komórkowych nowotworów, brak p53 w proteomie płytek krwi, jak również brak funkcjonalnego genomu w płytkach sugeruje, że acetylacja p53 będzie miała minimalny wpływ na biologię płytek krwi.

Najnowsze postępy w proteomice o wysokiej przepustowości w połączeniu z sondami opartymi na aktywności doprowadziły do identyfikacji setek przypuszczalnych acetylacji pośredniczonych przez aspirynę. W jednym z podejść, grupa acetylowa aspiryny została zastąpiona kwasem pentynowym w celu wytworzenia pochodnej aspiryny zawierającej alkiny (AspAlk). W przeciwieństwie do aspiryny, przeniesienie acetylu przez AspAlk powoduje przyłączenie reagującego z azydkiem alkinu w miejscach normalnie acetylowanych przez aspirynę. Po inkubacji AspAlk z żywymi komórkami HCT-15, białka acetylowane przez AspAlk były znakowane biotyną poprzez katalizowaną miedzią cykloaddycję azydkowo-alkilową (CuAAC) i izolowane poprzez streptawidynę pulldown. Po analizie LC-MS, autorzy byli w stanie zidentyfikować 120 białek z istotnym wzbogaceniem acetylacji AspAlk w stosunku do kontroli DMSO. Najbardziej wzbogaconymi klasami białek w tym badaniu były te zaangażowane w syntezę i składanie białek, białka cytoszkieletu i enzymy metaboliczne. Zaobserwowano również acetylację histonów, która została potwierdzona biochemicznie. Praca ta została rozszerzona w ostatnim manuskrypcie Shen, Lin i współpracowników, którzy użyli azydku biotyny o właściwościach kwaśnych, aby ułatwić odzyskiwanie białek zmodyfikowanych AspAlk po koniugacji z biotyną i odłączeniu streptawidyny. Dzięki tej strategii udało się zidentyfikować ponad 500 acetylowanych białek. Analiza szlaków docelowych wykazała znaczącą acetylację w obrębie szlaku mTOR, który kontroluje wiele kluczowych funkcji komórkowych, w tym syntezę białek i autofagię. Autorzy potwierdzili wstępne obserwacje proteomiczne, wykazując, że leczenie aspiryną zarówno komórek jelita grubego HCT116, jak i fibroblastów embrionalnych myszy, zmniejsza syntezę białek de novo i indukuje autofagię. Indukcja autofagii przez aspirynę jest szczególnie interesująca w świetle ostatnich badań wykazujących, że autofagia jest niezbędna dla prawidłowej funkcji płytek krwi i jest zwiększona podczas stymulacji płytek krwi. Co więcej, funkcjonalna maszyneria autofagiczna jest niezbędna dla aktywności przeciwzakrzepowej płytek krwi, jak wykazano w modelach mysich, w których znokautowano płytkową Atg7. Podczas gdy funkcjonalny związek pomiędzy acetylacją wywołaną przez aspirynę a indukcją autofagii płytek krwi pozostaje niejasny, zahamowanie szlaku fosforanu pentozy (PPP) poprzez blokadę G6PD lub zaburzenie oddychania mitochondrialnego poprzez acetylację dehydrogenazy jabłczanowej i/lub dehydrogenazy izoctanowej może zwiększyć wewnątrzkomórkowe obciążenie oksydacyjne, co jest znanym czynnikiem wyzwalającym autofagię. Alternatywnie, istnieje wiele dowodów na pośredniczoną przez aspirynę acetylację chaperonów, szczególnie białek szoku cieplnego i izomeraz peptydylowo-prolylowych, które mogą upośledzać prawidłowe składanie białek i wyzwalać autofagiczne usuwanie źle złożonych białek.

Inne niedawne badanie proteomiczne przeprowadzone przez Tatham i współpracowników wykorzystało aspirynę znakowaną 3H do identyfikacji miejsc acetylacji w komórkach HeLa za pomocą spektrometrii mas. W tym podejściu zastosowanie aspiryny tritowanej powoduje przesunięcie masy o +3 Da w stosunku do zwykłego octanu i pozwala na dokładniejszą dyskryminację acetylacji spowodowanej aspiryną w porównaniu z acetylacją endogenną. Podejście to ujawniło ponad 12 000 acetylacji spowodowanych aspiryną w ponad 3700 unikalnych białkach. Co ciekawe, wiele białek acetylowanych przez aspirynę było również acetylowanych przy braku aspiryny, co sugeruje, że aspiryna „wzmacnia” istniejące miejsca acetylacji białek. Autorzy tego badania stwierdzili również, że w większości przypadków, <1% wszystkich miejsc dostępnych do acetylacji na każdym konkretnym białku było acetylowanych przez aspirynę, co sugeruje, że stechiometria niespecyficznej acetylacji wywołanej przez aspirynę może być niewystarczająca do wywołania znaczących efektów biologicznych bez farmakologicznej blokady aktywności endogennej deacetylazy.

Badanie to wykazało również znaczącą acetylację białek histonowych, przy czym większość acetylacji wywołanej przez aspirynę zachodziła w rdzeniu histonu, a nie w N-końcowych ogonach. Acetylacja histonów została zaobserwowana w wielu badaniach proteomicznych i nie jest niczym zaskakującym, biorąc pod uwagę wysoki udział nukleofilowych reszt lizyny w histonach, które odgrywają znaczącą rolę w elektrostatycznym wiązaniu DNA. Acetylacja histonów odgrywa krytyczną rolę w wiązaniu DNA i jest dobrze znanym mechanizmem epigenetycznym regulującym ekspresję genów. Chociaż płytki krwi są anukleatami, poprzednie badania transkryptomiczne zidentyfikowały specyficzne dla histonów transkrypty w płytkach krwi, szczególnie H2A, H2B, H3 i H4. Chociaż acetylacja histonów przez aspirynę została przekonująco wykazana, należy zauważyć, że ekspresja histonów nie została potwierdzona w płytkach krwi. Postuluje się raczej, że obecność transkryptów histonów w płytkach krwi jest artefaktem nieprawidłowego cyklu komórkowego w megakariocytach, z których powstają płytki krwi. Co ważniejsze, rola histonów w kontrolowaniu ekspresji na poziomie DNA jest nieobecna w anukleatach płytek krwi.

Wpływ aspiryny na metabolizm płytek krwi

Metabolizm płytek krwi jest przede wszystkim oksydacyjny w przeciwieństwie do neutrofili, które są przede wszystkim glikolityczne. Blokada glikolizy beztlenowej nie powoduje zmniejszenia ATP ani nie hamuje funkcji płytek krwi. Wykazano, że acetylacja enzymów cyklu kwasu trójkarboksylowego (TCA) i elementów łańcucha transportu elektronów (ETC) jest powszechną metodą regulacji, szczególnie dla enzymów zaangażowanych w metabolizm, takich jak dehydrogenaza jabłczanowa w metabolizmie węgla, regulacji metabolizmu lipidów i w cyklu mocznikowym do detoksykacji amoniaku. Wynika z tego, że acetylacja enzymów cyklu TCA i składników ETC może mieć istotny wpływ na bioenergetykę płytek krwi. Badania proteomiczne acetylacji aspiryny konsekwentnie ujawniają acetylację dehydrogenazy jabłczanowej, która reguluje przełączanie między syntezą węglowodanów i kwasów tłuszczowych oraz dehydrogenazy izoctanowej, która jest regulowana w mitochondriach przez deacetylację za pośrednictwem białek sirtuiny (Sirt3 i Sirt5). Aktywność deacetylazy sirtuin jest związana z szeregiem enzymów TCA w macierzy mitochondrialnej i uważa się, że reguluje regenerację antyoksydantów, regulację strumienia TCA i anapleurozę. Podczas gdy w momencie przygotowywania i drukowania tego przeglądu nie jesteśmy świadomi żadnych badań, które bezpośrednio odnoszą się do zakresu acetylacji enzymów metabolicznych spowodowanej aspiryną lub wpływu aspiryny na strumień metaboliczny, dowody proteomiczne sugerują, że może to być ważny niekanoniczny efekt aspiryny na biochemię płytek krwi.

Wpływ aspiryny na lokalizację płytek krwi w guzach

Pojawiają się nowe dowody na to, że same płytki krwi mogą odgrywać istotną rolę w kancerogenezie, a dokładniej w rozwoju przerzutów. W mysich modelach przerzutowych, w których komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do krążenia, strategie mające na celu zmniejszenie liczby krążących płytek krwi okazały się skuteczne w zmniejszaniu obciążenia nowotworowego. Inne badania w modelach przerzutowych, w których rozpuszczalna fibryna i komórki nowotworowe były wstrzykiwane w celu wzmocnienia efektu krzepnięcia, wykazały zwiększoną częstość występowania przerzutów in vivo. Badania te były wspierane przez eksperymenty in vitro, gdzie rozpuszczalna fibryna wzmocniła interakcje między płytkami krwi a komórkami nowotworowymi w warunkach hodowlanych. Badania te wspierają hipotezę, że aktywacja agregacji płytek krwi, oprócz oczekiwanego wzrostu fibryny, zwiększa adhezję płytek krwi do komórek nowotworowych i ułatwia rozprzestrzenianie się przerzutów. Oprócz fibryny, dodatkowe badania uwzględniły rolę trombiny, PAR-1 i czynnika krzepnięcia VII (FVII) oraz ich związek ze zwiększeniem żywotności komórek nowotworowych, wzrostem i rozprzestrzenianiem się nowotworu, zwiększoną złośliwością guza i wspieraniem przerzutów .

Oprócz modulowania biologii komórek nowotworowych w krążeniu ogólnoustrojowym, wykazano również, że płytki krwi odgrywają ważną rolę we wzroście komórek nowotworowych. W jednym z badań wykazano, że aspiryna znacznie zmniejszyła stopień proliferacji komórek zarówno in vitro, jak i in vivo raka jajnika. W tym samym badaniu stwierdzono również, że aktywacja płytek krwi może zwiększyć proliferację i wzrost komórek nowotworowych po koinkubacji komórek nowotworowych i płytek krwi. Zahamowanie receptorów adhezyjnych płytek krwi, w tym GPIβα, GPIIβIIIα i selektyny P nie zmniejszyło jednak efektów proliferacyjnych pochodzących z płytek krwi. Sugeruje to, że wydzielane przez płytki krwi białka i inne czynniki mogą odgrywać rolę w regulacji wzrostu komórek nowotworowych. Na przykład zaobserwowano, że redukcja płytkowego TGF-β1 zmniejszała proliferację komórek raka jajnika eksponowanych na płytki krwi. Ponadto wykazano, że aspiryna zapobiega przerzutom raka jelita grubego poprzez mechanizm COX-1 z udziałem TXA2 i PGE2, co sugeruje, że aktywowane płytki krwi mogą wspierać przerzuty poprzez zależną od COX-1 produkcję prostaglandyn. Ponadto wykazano, że nowy koniugat aspiryny z fosfotydylocholiną (Aspirin-PC) zakłóca indukowane przez płytki krwi i komórki nowotworowe przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) poprzez uwalnianie VEGF i tromboksanu. Stwierdzono również, że preparat ten hamuje proliferację komórek i angiogenezę, jednocześnie zwiększając apoptozę w modelach komórkowych raka jajnika i raka jelita grubego .