Koehenkilöt ja kuvantamismenetelmät
Koe 1 (3.0 T): Kaksikymmentä tervettä aikuista (11 miestä, ikä 26.2 ± 3.1 vuotta) antoi tietoon perustuvan suostumuksen osallistua kokeeseen. 16 osallistujan tiedot on jo raportoitu aiemmassa tutkimuksessamme15. Neljä osallistujaa rekrytoitiin hiljattain tätä tutkimusta varten. Poissulkukriteereihin kuului merkittävä psykiatrinen tai neurologinen historia. Toronton yliopiston tutkimuseettinen lautakunta (REB) ja SickKidsin sairaalan REB hyväksyivät tämän tutkimuksen. Tilastollista testiä ei tehty otoskoon määrittämiseksi etukäteen. Valitsemamme otoskoko on samanlainen kuin aiemmissa julkaisuissa16, 26. Koe suoritettiin 3,0 T:n fMRI-järjestelmällä (Siemens Trio). Lokalisointikuvat kerättiin ensin, jotta näkökenttä (FOV) saatiin kohdistettua keskitetysti kunkin osallistujan aivoihin. T1-painotetut anatomiset kuvat otettiin (1 mm3, 256 × 256 FOV; MPRAGE-sekvenssi) ennen kokeellisia kaiku-planaarikuvausjaksoja (EPI). Toiminnallisessa kuvantamisessa käytettiin gradientti-echo-planar-sekvenssiä (toistoaika (TR) = 2000 ms; kaikuaika (TE) = 27 ms; kääntökulma = 70°). Kukin toiminnallinen ajo koostui 263 koko aivojen kuvauksesta (40 × 3,5 mm:n viipaleet; lomitettu hankinta; FOV = 192 mm; matriisikoko = 64 × 64; tason sisäinen resoluutio 3 mm). Kunkin ajon neljä ensimmäistä toiminnallista kuvaa jätettiin analyysin ulkopuolelle, jotta pitkittäismagnetisaatio saatiin tasaantumaan.
Koe 2 (7,0 T): Yksitoista tervettä aikuista (6 miestä, ikä 22.2 ± 2.2 vuotta) antoi tietoon perustuvan suostumuksen osallistua kokeeseen. Japanin kansallisen fysiologisten tieteiden instituutin eettinen komitea hyväksyi tämän tutkimuksen. Tilastollista testiä ei suoritettu otoskoon määrittämiseksi etukäteen. Valitsemamme otoskoko on samanlainen kuin aiemmissa julkaisuissa16, 26. Koe suoritettiin 7,0 T:n fMRI-järjestelmällä (Siemens Magnetom). Lokalisointikuvat kerättiin ensin, jotta FOV kohdistettiin keskitetysti kunkin osallistujan aivoihin. T1-painotetut anatomiset kuvat otettiin (0,75 mm isometrinen, 224 × 300 FOV; MPRAGE-sekvenssi). Toiminnallisessa kuvantamisessa käytettiin gradientti-echo-planar-sekvenssiä (TR = 500 ms; TE = 25 ms; kääntökulma = 35°; monikaistakerroin = 4). Kukin toiminnallinen ajo koostui 1010 koko aivojen kuvauksesta (32 × 2,0 mm:n viipaleet; lomitettu hankinta; FOV = 208 mm; matriisikoko = 104 × 104; tason sisäinen resoluutio 2 mm). Kunkin ajon neljä ensimmäistä toiminnallista kuvaa jätettiin analyysin ulkopuolelle, jotta pitkittäismagnetisaatio saatiin tasaantumaan.
Käyttäytymismenettelyt
Koe 1: Gustatoriset ärsykkeet annettiin muoviputkilla, jotka yhtyivät muoviseen jakoputkeen, jonka suuttimesta tiputettiin makuliuoksia suuhun. Putket oli esitäytetty siten, että visuaalisen ärsykkeen esittämisen ja nesteen annostelun välillä ei ollut juuri lainkaan viivettä. Sata makuliuoskokeilua satunnaistettiin ja tasapainotettiin viidessä ajossa. Kussakin kokeessa 0,5 ml makuliuosta annettiin 1244 ms:n aikana. Kun nesteen luovutus päättyi, näyttö kehotti osallistujia nielemään nesteen (1 s). 7756 ms:n kuluttua ilmestyivät asteikkopalkit, jotka arvioivat nesteen positiivisuutta (3 s) ja sitten negatiivisuutta (3 s). Tämän jälkeen annettiin 0,5 ml mautonta nestettä 1244 ms:n aikana huuhtelua varten, minkä jälkeen annettiin 1 s:n nielemisohje. Kokeiden välisen 7756 ms:n intervallin jälkeen alkoi seuraava koe.
Koe 2: Verrattuna kokeeseen 1, gustatoristen ärsykkeiden anto erosi vain niiden ajoituksen ja määrän suhteen. Sata makuliuoskokeilua satunnaistettiin ja tasapainotettiin viidessä ajossa. Jokaisessa kokeessa 0,88 ml makuliuosta annettiin 2 s:n aikana. Kun nesteen toimitus päättyi, näyttö kehotti osallistujia nielemään nesteen (2 s). 4000 ms:n kuluttua ilmestyivät asteikkopalkit, jotka arvioivat nesteen positiivisuutta (3 s) ja sitten negatiivisuutta (3 s). Tämän jälkeen annettiin 0,88 ml mautonta nestettä 2 s:n aikana huuhtelua varten, minkä jälkeen annettiin 2 s:n nielemisohje. 7 s:n kokeilujen välisen intervallin jälkeen alkoi seuraava kokeilu.
Kokeilua edeltävä istunto
Koe 1: Yksilöllisten erojen huomioon ottamiseksi eri makujen subjektiivisissa kokemuksissaan osallistujia pyydettiin maistamaan eri makuliuosten (hapan, suolainen, karvas ja makea) laajempaa intensiteettivalikoimaa (mitattuna molaarisilla pitoisuuksilla). Tässä esikokeessa osallistujille testattiin 1 kokeilukerta (2 ml) kutakin 16 makuliuosta seuraavasti: (1) hapan/sitruunahappo: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M ja 1,0 × 10-2 M; (2) suolainen/ruokasuola: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M ja 1,0 × 10-1 M; (3) karvas/kiniinisulfaatti: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M ja 7,8 × 10-6 M; ja (4) makea/sakkaroosi: Esitysjärjestys satunnaistettiin makujen mukaan ja sitten kunkin maun sisällä olevien pitoisuuksien mukaan. Jokaisen liuoksen juomisen jälkeen osallistujat huuhtelivat ja nielivät 5 ml vettä ja arvioivat sitten liuoksen kokemuksen voimakkuutta ja miellyttävyyttä (valenssi) erillisillä asteikoilla 1-9. Kunkin maun osalta valittiin intensiteetiltään vastaavat pitoisuudet. Aikaisempi työ2 oli osoittanut, että osallistujilla on erilaiset arvioinnin lähtötasot ja että luotettavimmin valitut pitoisuudet ovat keskitason yläpuolella itse arvioitua intensiteettiä. Kaikki liuokset sekoitettiin käyttämällä Sigma Aldrichin (http://www.sigmaaldrich.com) farmaseuttista laatua olevia kemiallisia yhdisteitä, jotka ovat turvallisia nautittavaksi.
Koe 2: Osallistujille tehtiin yksi kokeilu (1 ml) kutakin 16 makuliuosta seuraavasti: (1) makea 1/glukoosi: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M ja 0,38 M; (2) makea 2/sukraloosi: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M ja 0,26 × 10-4 M; (3) kitkerä 1/katechiini: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M ja 4,4 × 10-3 M; ja (4) kitkerä 2/magnesiumklorid: Esitysjärjestys satunnaistettiin makujen mukaan ja sitten kunkin maun sisällä olevien pitoisuuksien mukaan. Jokaisen liuoksen juomisen jälkeen osallistujat huuhtelivat ja nielivät 5 ml vettä ja arvioivat sitten liuoksen kokemuksen voimakkuutta ja miellyttävyyttä (valenssi) erillisillä asteikoilla 1-9. Kunkin maun osalta valittiin intensiteetiltään vastaavat pitoisuudet. Kaikki liuokset sekoitettiin käyttäen DHC:n (katekiini), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporationin (magnesiumkloridi), Tsuruya Chemical Industriesin (sukraloosi) ja Nichigan (glukoosi) elintarvikelaatuisia kemiallisia yhdisteitä.
Tietojen analysointi
Tiedot analysoitiin SPM8-ohjelmistolla (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Toiminnalliset kuvat kohdistettiin uudelleen, viipaleen ajoitus korjattiin ja normalisoitiin MNI-malliin (ICBM 152) interpoloimalla 2 × 2 × 2 mm:n tilaan. Tiedot tasoitettiin spatiaalisesti (täysi leveys, puolikas maksimi (FWHM) = 6 mm) yksimuuttujaparametrista modulaatioanalyysia varten, mutta ei multivokselikuvioanalyysia varten, koska se voi heikentää suorituskykyä19. Jokainen ärsykkeen esitys mallinnettiin erillisenä tapahtumana SPM8:n kanonisen funktion avulla. Kunkin vokselin osalta yksittäisten kokeiden t-arvot alennettiin vähentämällä kokeiden keskiarvo. Kuvantamistulosten visualisoimiseksi käytettiin freesurfer-ohjelmistoa39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) ja SPM surfrend-työkaluryhmää (kirjoittanut I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) muokkauksen jälkeen.
Yksilöllinen analyysi
Suoritimme yksimuuttujaisia analyysejä tutkiaksemme, koodasivatko perusmakuja tietyt vokselit insulassa. Kutakin makuaineita koodaavat regressorit sidottiin ajallisesti ärsykkeen esittämiseen. Univariaattiset analyysit suoritettiin kahdesti: hedonisen valenssin regressoreiden kanssa ja ilman niitä (Kuva 1). Jotta voitaisiin havainnollistaa, kuinka paljon varianssia voitaisiin selittää hedonisilla valenssiregressoreilla karvasherkillä alueilla, valitsimme merkittävät vokselit kontrastissa ”karvas vs. mauton” ilman valenssiregressoria (täydentävä kuva 1). Keskimääräinen aktiivisuus näytettiin aktiivisuudelle suhteessa lepotilan lähtötasoon (täydentävä kuva 1a), aktiivisuudelle suhteessa mauttomaan (täydentävä kuva 1b) ja aktiivisuudelle suhteessa mauttomaan, kun valenssi on regressoitu pois (täydentävä kuva 1c). Vokselikohtaisen makuvirityksen olemassaolon testaamiseksi jaoimme kunkin osallistujan parittomat ja parilliset juoksut ja vertasimme parittomien juoksujen kunkin maun vokselin aktiivisuutta kunkin maun vokselin aktiivisuuteen parillisissa juoksuissa. Havainnollistamiseksi, kun voxelit järjestettiin paremmuusjärjestykseen kunkin maun aktivoinnin perusteella parillisissa juoksuissa, löysimme johdonmukaisia malleja vastaavasti vähenevästä aktivoinnista kaikille neljälle maulle parittomissa juoksuissa (Kuva 1b, Täydentävä kuva 4). Korrelaatiot laskettiin vokselien aktivoinnille parittomien ja parillisten juoksujen välillä kaikkien makuyhdistelmien välillä kunkin osallistujan sisällä, ja ne toimitettiin yhden otoksen t-testillä osallistujien välillä (Kuva 1c, Kuva 4a, b). Laskimme lisäksi korrelaatiot parittomien ja parillisten juoksujen välillä kaikille saman maun ja eri makuyhdistelmille kussakin osallistujassa. Korrelaatiokertoimet muunnettiin z-muunnoksella ja niille tehtiin yhden otoksen t-testi osallistujien välillä (Kuva 1d, Kuva 4b, d).
Searchlight-analyysi makutyypin representaatioille
Analysoimme fMRI-tiedot insulaarisesta aivokuoresta käyttämällä searchlight-analyysiä (4 mm: n säde, mukaan lukien 33 vokselia) analyysi20. Kunkin osallistujan tietyn pallon sisällä luotiin vektori, joka sisälsi BOLD-MRI-signaalin spatiaalisen kuvion, joka oli ajallisesti sidottu ärsykkeen esitykseen (normalisoidut t-arvot vokselia kohti). Arvioidaksemme, pystyvätkö aktiivisuuskuviot etsintäpalloissa erottamaan makutyypit, käytimme leave-one-stimulus-pair-out cross-validation40. Tässä menettelyssä LDA-luokittelija koulutettiin 38 kokeella, jotka sisälsivät testatun makutyypin ja toisen makutyypin (19 koetta kummallekin), ja testattiin sitten pois jätetyllä ärsykeparilla. Kunkin maun luokittelusuoritukset keskiarvoistettiin vertailuissa muiden makujen kanssa (esim. hapan luokittelusuoritukset keskiarvoistettiin hapan vs. makea, hapan vs. karvas, hapan vs. suolainen ja hapan vs. mauton). Yksilötasolla 58,7 %:n luokittelutarkkuus vastasi p < 0,05 korjaamattomana. Ryhmäanalyysiä varten yksilölliset luokittelusuorituskartat tasoitettiin 4 mm FWHM Gaussin ytimellä ja sitten niille tehtiin yhden otoksen permutaatiotesti käyttäen SnPM13:a (http://warwick.ac.uk/snpm). Tässä menettelyssä kunkin osallistujan tiedot käännettiin satunnaisesti kertomalla – 1 sen jälkeen, kun niistä oli vähennetty 50 % (satunnaistason tarkkuus), ja sitten niille tehtiin yhden otoksen t-testi osallistujien välillä. Tämä permutoitiin 10,000 kertaa, jolloin saatiin maksimaalisen t:n jakauma insulan sisällä. Tämän jakauman perusteella määritettiin 5% FWE-kynnysarvo.
Makujen yhdistelmäanalyysi
Monimakuisen yhdistelmäanalyysin (Kuva 2b) osalta kukin vokseli testattiin siitä, ylittikö se kynnyksen neljälle makutyyppidiskriminaatiolle, jossa kukin makutyyppidiskriminaatio keskiarvoitti luokittelusuorituksen neljässä vertailussa (esim. hapan vs. makea, hapan vs. kitkerä, hapan vs. suolainen ja hapan vs. mauton) ylittäen satunnaisluokittelun (50%). Kelvollinen konjunktiopäätelmä edellyttää merkitseviä tuloksia kaikissa vertailuissa41. Laskimme siis 5 % FWE-kynnyksen täyttävien makutyyppien määrän kussakin vokselissa insulan sisällä.
Makuparianalyysi
Kohtaisten makuparien analysoimiseksi tarkastelimme itsenäisesti määriteltyä ROI:ta insulan sisällä. Ensin käytimme leave-one-subject-out-menettelyä, jättäen jokaisen 20-koehenkilön pois ja laskimme sitten 4-maun yhdistelmäkartan (ts. Vokselit, jotka täyttävät kaikki edellä kuvatut 4-makukontrastit) jäljelle jääneiden 19-koehenkilöiden kanssa, jolloin saatiin 20-karttoja. Näiden 20 ryhmäkartan päällekkäisyys on esitetty kuvassa 2c. Kartan vokselit, jotka täyttävät 5 prosentin FWE-kynnyksen, määriteltiin ROI:ksi, joka kykenee makujen erotteluun. Tämän ROI:n sisällä tutkittiin tiettyjen makuparien erottelukykyä ja laskettiin kunkin makuparin luokittelusuorituskyky. Ryhmän suorituskyky laskettiin keskimääräisenä luokittelusuorituksena 20-koehenkilöiden välillä (Kuva 2d).
Valenssiluokituksiin perustuvan makuparien erottelun (Kuva 2e) osalta suoritimme LDA-analyysin käyttäen subjektiivisia valenssiluokituksia (eli riippumattomia fMRI-tiedoista). Valenssi laskettiin vähentämällä negatiivisuusluokitus positiivisuusluokituksesta kunkin kokeen osalta. Makuluokitus laskettiin käyttämällä leave-one-trial-out -koulutusta 19 jäljellä olevista kokeista kunkin makutyypin osalta.
Valenssi- ja makutyyppianalyysi
Testataksemme makutyypin riippumattomuutta valenssista, tarkastelimme fMRI-tietojen samankaltaisuutta ROI: n sisällä, joka oli määritelty edellä esitetyllä neljän maun yhdistelmäkartalla. Kullekin aiheelle laskettiin kokeilukohtaiset korrelaatiot, jolloin saatiin 4950 (100 × 99 / 2) korrelaatiokertoimia, jotka lajiteltiin 2 × 2 -luokkiin makutyyppi (sama, erilainen) × hedoninen valenssi (sama, erilainen). Korrelaatiokertoimet keskiarvoistettiin kussakin solussa per koehenkilö, minkä jälkeen kaikkien koehenkilöiden tiedoille tehtiin kaksisuuntainen toistettujen toimenpiteiden ANOVA, jossa makutyyppi ja valenssi olivat tekijöinä (Kuva 2g).
Suoritimme lisäksi seuranta-analyysin, jossa ei ollut tietojen riippuvuutta kokeilukohtaisissa korrelaatioissa 2 × 2-soluissa. Täytimme satunnaisesti jokaisen solun 100-kokeilla ja toistimme tämän menettelyn 1,000,000 kertaa. Näistä analysoimme permutaation, jolla oli suurin yhtenevyys 2 × 2-tekijöiden ja todellisten kokeiluluokkien välillä (perustuen pelkistettyjen tietojen osuuden suurimpaan geometriseen keskiarvoon neljässä solussa). Tämän jälkeen laskimme kokeiden väliset korrelaatiot vain kunkin solun sisällä varmistaaksemme, ettei solujen välistä riippuvuutta ole. Korrelaatiokertoimet keskiarvoistettiin kunkin solun sisällä kutakin koehenkilöä kohti, minkä jälkeen kaikkien jäljelle jääneiden koehenkilöiden tiedot toimitettiin kaksisuuntaiselle toistettujen toimenpiteiden ANOVA: lle (Täydentävä kuva 3).
Makutyyppikuviot erosivat toisistaan riippumatta makuvalenssista, toisin sanoen makudiskriminaatiokartat olivat erotettavissa maistuvuudesta. Makutyypin ja valenssin välisen voimakkaan yhteyden vuoksi koeyhdistelmät eivät olleet tasavertaisia eri tasoilla. Esimerkiksi sama valenssi eri makutyyppien kanssa oli suhteellisen harvinaista (lisätaulukko 4). Tämä ei kuitenkaan viittaa vaikutuksen koon multikollineaarisuuteen.
Tilastot
Analysoimme tiedot olettamatta normaalijakaumaa käyttäen ei-parametrisia tilastoja. Ennen ANOVAa (kuva 2g) suoritettiin Levenen testi sen varmistamiseksi, että homoskedastisuusoletus täyttyy. Moninkertaisen vertailun korjauksia sovellettiin käyttäen Bonferroni-korjausta.
Raportointiyhteenveto
Lisätietoa koesuunnittelusta on saatavilla tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.
