Histoni-modifikaatio on histoniproteiinien kovalenttinen posttranslationaalinen modifikaatio (PTM), joka käsittää metylaation, fosforylaation, asetylaation, ubikvitylaation ja sumoylaation. Histoneihin tehdyt PTM:t voivat vaikuttaa geeniekspressioon muuttamalla kromatiinin rakennetta tai rekrytoimalla histonimodifioijia. Histoniproteiinit pakkaavat DNA:n, joka kiertyy kahdeksan histonin ympärille, kromosomeihin. Histonimodifikaatiot vaikuttavat erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten transkription aktivoinnissa/inaktivoinnissa, kromosomien pakkaamisessa ja DNA:n vaurioitumisessa/korjaamisessa. Useimmissa lajeissa histoni H3 on pääasiassa asetyloitu lysiineissä 9, 14, 18, 23 ja 56, metyloitu arginiini 2:ssa ja lysiineissä 4, 9, 27, 36 ja 79 sekä fosforyloitu ser10:ssä, ser28:ssa, Thr3:ssa ja Thr11:ssä. Histoni H4 on pääasiassa asetyloitunut lysiineissä 5, 8, 12 ja 16, metyloitunut arginiini 3:ssa ja lysiini 20:ssä ja fosforyloitunut seriini 1:ssä. Näin ollen erilaisten histonimodifikaatioiden kvantitatiivinen havaitseminen antaisi hyödyllistä tietoa soluprosessien epigeneettisen säätelyn ymmärtämiseksi paremmin ja histonimodifioiviin entsyymeihin kohdistettujen lääkkeiden kehittämiseksi.
Histonin asetylaatio/deasetylaatio
Histonin asetylaatio tapahtuu entsymaattisella asetyyliryhmän (COCH3) lisäyksellä asetyylikoentsyymi A:sta. Histoniasetylaatioprosessi osallistuu tiiviisti monien soluprosessien säätelyyn, kuten kromatiinin dynamiikkaan ja transkriptioon, geenien hiljentämiseen, solusyklin etenemiseen, apoptoosiin, erilaistumiseen, DNA:n replikaatioon, DNA:n korjaamiseen, ydintuontoon ja hermosolujen repressioon. Histoniasetylaatioon osallistuvia modifioivia entsyymejä kutsutaan histoniasetyltransferaaseiksi (HAT), ja niillä on kriittinen rooli histoni H3:n ja H4:n asetylaation säätelyssä. On tunnistettu yli 20 HAT:ia, jotka voidaan luokitella viiteen perheeseen: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP ja ydinreseptorien koaktivaattorit, kuten ACTR.1 Histoni H3:n asetylaatio voi lisääntyä estämällä histonideasetylaaseja (HDAC) ja vähentyä HAT:n estolla.
Histonideasetylaasit (HDAC) katalysoivat asetyyliryhmien hydrolyyttistä poistamista histonien lysiinijäännöksistä. Epätasapaino histoniasetylaation tasapainossa on yhdistetty kasvainten syntyyn ja syövän etenemiseen. Sen havaitseminen, onko histoni H3:n lysiinijäämät asetyloidut, tarjoaisi hyödyllistä tietoa asetylaatiomallien tai -paikkojen tarkempaa karakterisointia varten, mikä johtaisi parempaan ymmärrykseen geenien aktivoitumisen epigeneettisestä säätelystä sekä HAT:lle suunnattujen lääkkeiden kehittämiseen. HAT:ien tavoin HDAC:illa on kriittinen rooli erilaisissa soluprosesseissa, joihin histoni H3 ja H4 osallistuvat. Tähän mennessä on tunnistettu ainakin neljä HDAC-luokkaa. Luokkaan I kuuluvat HDAC:t 1, 2, 3 ja 8. Luokkaan II kuuluvat HDAC:t 4, 5, 6, 7, 9 ja 10. Luokan III entsyymit, jotka tunnetaan nimellä sirtuiinit, vaativat NAD+ -kofaktoreita, ja niihin kuuluvat SIRTit 1-7. Luokan IV entsyymillä, joka sisältää vain HDAC11:n, on sekä luokan I että II piirteitä. HDAC:n estolla on merkittäviä vaikutuksia apoptoosiin, solusyklin pysähtymiseen ja erilaistumiseen syöpäsoluissa. HDAC:n estäjiä kehitetään parhaillaan syöpälääkkeiksi.2
Extraktoi ydinproteiinit kiinnostavasta näytteestäsi ja käytä sitten ELISA:n kaltaista menetelmää HDAC-proteiinien määrän tai HDAC:n aktiivisuustasojen tai HAT:n aktiivisuustasojen mittaamiseen.
Histonin metylaatio/demetyloituminen
Histonin metylaatiolla tarkoitetaan histonimetyylitransferaasien (histone methyltransferases, HMT:t) suorittamaa metyyliryhmän siirtoa yhdestä, kahdesta tai kolmesta metyyliryhmästä S-adenosyyli-L-metioniinista histoniproteiinien lysiini- tai arginiinijäännöksiin. HMT:t kontrolloivat tai säätelevät DNA:n metylaatiota kromatiinista riippuvan transkription repression tai aktivoinnin kautta. Kun histonimetylaatio tapahtuu solun ytimessä, histonin kanssa kompleksissa olevan DNA:n tietyt geenit voivat aktivoitua tai hiljentyä.3 On olemassa useita erilaisia histonimetyylitransferaaseja, jotka ovat spesifisiä sen lysiini- tai arginiinijäännöksen suhteen, jota ne muokkaavat. Histoni H3:n osalta esimerkiksi SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx ja SMYD3 ovat histonimetyylitransferaaseja, jotka katalysoivat histoni H3:n metylaatiota lysiini 4:ssä (H3-K4) nisäkässoluissa. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 ja Eu-HMTase ovat histonimetyylitransferaaseja, jotka katalysoivat histoni H3:n metylaatiota lysiinissä 9 (H3-K9) nisäkässoluissa. G9a ja polykombiryhmän entsyymit, kuten EZH2, ovat histonimetyylitransferaaseja, jotka katalysoivat histoni H3:n metylaatiota lysiinin 27 kohdalla (H3-K27) nisäkässoluissa.4 Sekä H3-K9:n että H3-K27:n metylaatio välittää heterokromatiinin muodostumista, ja se osallistuu myös geenien ilmentymisen vaimentamiseen euchromaattisissa kohdissa. Lisääntyneen globaalin H3-K27-metylaation on myös todettu olevan osallisena joissakin patologisissa prosesseissa, kuten syövän etenemisessä.
Toisaalta histonien H3 ja H4 arginiinimetylaatio edistää transkription aktivoitumista, ja sitä välittää proteiinien arginiinimetyylitransferaasien (PRMT) perhe. Ihmisistä löytyy 9 erilaista PRMT:tä, mutta vain 7 PRMT:n jäsenen on raportoitu metyloivan histoneja. Ne voivat välittää arginiinijäämien mono- tai dimetylaatiota. Metyyliryhmän lisäyksen sijainnin perusteella PRMT:t voidaan luokitella tyypin I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 ja PRMT8) ja tyypin II (PRMT5 ja PRMT7) ryhmiin. Tyypin II PRMT:iden on todettu olevan vahvasti mukana sairauksissa, kuten syövässä.5 Esimerkiksi PRMT5:llä on rooli tiettyjen kasvainsuppressorigeenien, kuten RB-kasvainsuppressorien, tukahduttamisessa, kun taas PRMT7:n yliekspressiota on havaittu rintasyövässä. Tyypin II PRMT:iden ja muiden HMT:iden aktiivisuuden ja eston havaitseminen olisi tärkeää geenien aktivoitumisen ja hiljentymisen epigeneettisen säätelyn mekanismien selvittämisessä ja hyödyttäisi syöpädiagnostiikkaa ja -terapiaa.
Aloita eristämällä histoniproteiinit kiinnostavista näytteistä ja valitse sitten sopiva ELISA-kitti histonien metylaatiotasojen havaitsemiseksi.
Histonien demetyloituminen on metyyliryhmien poistamista modifioiduista histoniproteiineista histonidemetylaasien avulla. Näillä demetylaaseilla on havaittu olevan mahdollisia onkogeenisiä toimintoja ja osallisuutta muihin patologisiin prosesseihin. Histonidemetylaasien löytyminen osoittaa, että histonimetylaatio ei ole pysyvä muutos vaan pikemminkin dynaamisempi prosessi. Kaksi suurta demetylaasiperhettä on löydetty: Lysiinispesifinen demetylaasi 1 (LSD1) ja Jumonji-domeenia sisältävät (JmjC-domeeni) histonidemetylaasit (JMJD2, JMJD3/UTX ja JARIDit). Spesifinen aminohappojäännös ja metylaatioaste määräävät demetylaatioentsyymin. Esimerkiksi histoni H3:ssa mono- ja di-metyloituneen lysiini 4:n demetyloi LSD1 (BHC110, KDM1) ja tri-metyloituneen lysiini 4:n JARID (1A-1D); JMJD3 ja UTX (KDM6A) demetyloivat di- ja tri-metyloituneen lysiini 27:n, ja JMJD1 demetyloi mono- ja di-metyloituneen lysiini 9:n ja JMJD2 demetyloi tri-metyloituneen lysiini 9:n.6 Histonidemetylaasien estäminen voi johtaa histonin uudelleenmetylaatioon tietyissä kromatiinin dynamiikan ja geeniekspression kannalta tärkeissä jäännöksissä. Lisäksi näiden entsyymien aktiivisuuden ja eston havaitseminen olisi tärkeää selvitettäessä geenien aktivoitumisen ja hiljentymisen epigeneettisen säätelyn mekanismeja, ja siitä voisi olla hyötyä syövän diagnostiikassa ja hoidossa.
Extraktoi ydinproteiinit kiinnostavasta näytteestäsi ja ota sitten käyttöön ELISA-pohjainen tekniikka LSD1- ja JmjC-domeeniperheisiin kuuluvien histonidemetylaasien aktiivisuus- ja inhibitiotasojen tutkimiseksi.
Valmis tutustumaan toiseen epigeneettiseen mekanismiin? Lue lisää: Koodaamaton RNA
