Subjektek és képalkotó eljárások
Kísérlet 1 (3.0 T): Húsz egészséges felnőtt (11 férfi, koruk 26,2 ± 3,1 év) tájékoztatott beleegyezését adta a kísérletben való részvételhez. A 16 résztvevő adatait korábbi tanulmányunkban már közöltük15. Négy résztvevőt újonnan toboroztunk ehhez a vizsgálathoz. A kizárási kritériumok közé tartozott a jelentős pszichiátriai vagy neurológiai kórtörténet. A vizsgálatot a Torontói Egyetem Kutatási Etikai Bizottsága (REB) és a SickKids kórház REB-je hagyta jóvá. A mintanagyság előzetes meghatározására nem végeztek statisztikai tesztet. Az általunk választott mintaméretek hasonlóak a korábbi publikációkban16, 26 használtakhoz. A kísérletet 3,0 T fMRI rendszerrel (Siemens Trio) végeztük. Először lokalizáló képeket gyűjtöttünk, hogy a látómezőt (FOV) az egyes résztvevők agyának közepére igazítsuk. A T1-súlyozott anatómiai képeket (1 mm3, 256 × 256 FOV; MPRAGE szekvencia) a kísérleti echo-planáris képalkotási (EPI) futtatások előtt készítették. A funkcionális képalkotáshoz gradiens echo-planáris szekvenciát használtunk (ismétlési idő (TR) = 2000 ms; visszhangidő (TE) = 27 ms; flipszög = 70°). Minden egyes funkcionális futtatás 263 teljes agyi felvételből állt (40 × 3,5 mm-es szeletek; interleaved felvétel; FOV = 192 mm; mátrixméret = 64 × 64; síkbeli felbontás 3 mm). Az egyes futások első négy funkcionális képét kizártuk az elemzésből, hogy lehetővé tegyük a longitudinális mágnesezettség kiegyenlítődését.
2. kísérlet (7,0 T): Tizenegy egészséges felnőtt (6 férfi, koruk 22,2 ± 2,2 év) tájékoztatott beleegyezését adta a kísérletben való részvételhez. Ezt a vizsgálatot a japán Nemzeti Fiziológiai Tudományos Intézet etikai bizottsága hagyta jóvá. A mintanagyság előzetes meghatározására nem végeztek statisztikai tesztet. Az általunk választott mintanagyságok hasonlóak a korábbi publikációkban16, 26 használtakhoz. A kísérletet 7,0 T fMRI rendszerrel (Siemens Magnetom) végeztük. Először lokalizáló képeket gyűjtöttünk, hogy a FOV-ot az egyes résztvevők agyának középpontjára igazítsuk. T1-súlyozott anatómiai felvételeket készítettünk (0,75 mm izometrikus, 224 × 300 FOV; MPRAGE szekvencia). A funkcionális képalkotáshoz gradiens echo-planáris szekvenciát használtunk (TR = 500 ms; TE = 25 ms; flipszög = 35°; multiband faktor = 4). Minden funkcionális futtatás 1010 teljes agyi felvételből állt (32 × 2,0 mm-es szeletek; interleaved felvétel; FOV = 208 mm; mátrixméret = 104 × 104; síkbeli felbontás 2 mm). Az egyes futások első négy funkcionális képét kizártuk az elemzésből, hogy lehetővé tegyük a longitudinális mágnesezettség kiegyenlítődését.
Viselkedési eljárások
1. kísérlet: A gusztációs ingereket egy műanyag elosztócsőbe konvergáló műanyag csövek adták, amelyek fúvókájából ízoldatokat csepegtettek a szájba. A csöveket előre feltöltötték úgy, hogy a vizuális inger megjelenése és a folyadék adagolása között szinte semmilyen késleltetés nem volt megfigyelhető. Száz ízoldat-kísérletet randomizáltunk és kiegyensúlyoztunk öt futtatásban. Minden egyes próbában 0,5 ml ízoldatot juttattak ki 1244 ms alatt. Amikor a folyadék adagolása véget ért, egy képernyő arra utasította a résztvevőket, hogy nyeljék le a folyadékot (1 s). 7756 ms után skálázó sávok jelentek meg, amelyek a folyadék pozitivitását (3 s), majd negativitását (3 s) értékelték. Ezt követte 0,5 ml íztelen folyadék adagolása 1244 ms alatt az öblítéshez, majd az 1 s-os nyelési utasítás. A 7756 ms inter-trial-intervallum után kezdődött a következő kísérlet.
2. kísérlet: Az 1. kísérlethez képest az ízlelési ingerek adagolása csak azok időzítésében és mennyiségében különbözött. Száz ízlelési oldatpróbát randomizáltunk és kiegyensúlyoztunk öt futtatásban. Minden egyes próbában 0,88 mL ízoldatot adtak 2 s alatt. Amikor a folyadék adagolása véget ért, egy képernyő utasította a résztvevőket, hogy nyeljék le a folyadékot (2 s). 4000 ms után skálázó sávok jelentek meg, amelyek a folyadék pozitivitását (3 s), majd negativitását (3 s) értékelték. Ezt követte 0,88 mL íztelen folyadék adagolása 2 s alatt az öblítéshez, majd a 2 s-os nyelési utasítás. A 7 s inter-trial-intervallum után kezdődött a következő kísérlet.
Kísérlet előtti ülés
1. kísérlet: A különböző ízekkel kapcsolatos szubjektív tapasztalatok egyéni különbségeinek figyelembevétele érdekében a résztvevőknek a különböző ízoldatok (savanyú, sós, keserű és édes) intenzitásának szélesebb (moláris koncentrációval mért) tartományát kellett megkóstolniuk. Ebben az előkísérleti szakaszban a résztvevők mind a 16 ízoldatból 1 próbát (2 ml) végeztek az alábbiak szerint: (1) savanyú / citromsav: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M és 1,0 × 10-2 M; (2) sós / asztali só: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M és 1,0 × 10-1 M; (3) keserű/kinin-szulfát: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M és 7,8 × 10-6 M; és (4) édes/cukros: A bemutatás sorrendjét ízek, majd az egyes ízeken belüli koncentrációk szerint randomizáltuk. Az egyes oldatok elfogyasztása után a résztvevők leöblítették és lenyeltek 5 ml vizet, majd külön 1-9-es skálán értékelték az oldat élményének intenzitását és kellemességét (valencia). Az egyes ízek közül azokat a koncentrációkat választották ki, amelyek intenzitásukban megegyeztek. Korábbi munkák2 kimutatták, hogy a résztvevők különböző értékelési alapokkal rendelkeznek, és a legmegbízhatóbban kiválasztott koncentrációk a közepes önbevallás szerinti intenzitás felett vannak. Minden oldatot a Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com) gyógyszerészeti minőségű kémiai vegyületeivel kevertünk, amelyek biztonságosak a fogyasztás szempontjából.
2. kísérlet: A résztvevők mind a 16 ízoldatból 1 próbát (1 ml) végeztek az alábbiak szerint: (1) édes 1/glükóz: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M és 0,38 M; (2) édes 2/szukralóz: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M és 0,26 × 10-4 M; (3) keserű 1/katechin: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M és 4,4 × 10-3 M; és (4) keserű 2/magnézium-klorid: A bemutatás sorrendjét ízek, majd az egyes ízeken belüli koncentrációk szerint randomizáltuk. Az egyes oldatok elfogyasztása után a résztvevők leöblítették és lenyeltek 5 ml vizet, majd külön 1-9-es skálán értékelték az oldat élményének intenzitását és kellemességét (valencia). Az egyes ízek közül az intenzitásban megegyező koncentrációkat választották ki. Minden oldatot a DHC (kathechin), a FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (magnézium-klorid), a Tsuruya Chemical Industries (szukralóz) és a Nichiga (glükóz) élelmiszer-minőségű kémiai vegyületeinek felhasználásával kevertünk.
Adatelemzés
Az adatokat az SPM8 szoftver (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/) segítségével elemeztük. A funkcionális képeket újrahangolták, a szeletek időzítését korrigálták, és az MNI-sablonra (ICBM 152) normalizálták, 2 × 2 × 2 mm-es térre interpolálva. Az adatokat térben simítottuk (teljes szélesség, félmaximum (FWHM) = 6 mm) az egyváltozós parametrikus modulációs elemzéshez, de nem a multivoxelmintázat elemzéséhez, mivel ez ronthatja a teljesítményt19. Minden egyes ingerbemutatót különálló eseményként modelleztünk az SPM8 kanonikus függvényének használatával. Minden egyes voxel esetében az egyes próbák t-értékeit lecsökkentettük a próbák átlagértékének levonásával. A képalkotási eredmények vizualizálásához a freesurfer szoftvert39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) és az SPM surfrend toolboxot (írta I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) használtuk módosítás után.
Univariate analysis
Univariate analízist végeztünk annak vizsgálatára, hogy az alapvető ízeket kódolják-e az insula specifikus voxelei. Az egyes ízeket kódoló regresszorokat az ingerbemutatáshoz időhöz kötöttük. Az univariáns elemzéseket kétszer végeztük el: hedonikus valencia regresszorokkal és anélkül (1. ábra). Annak szemléltetésére, hogy mennyi variancia magyarázható a hedonikus valencia regresszorokkal a keserűre érzékeny régiókban, kiválasztottuk a “keserű vs. íztelen” kontrasztban a szignifikáns voxeleket a valencia regresszálása nélkül (1. kiegészítő ábra). Az aktivitás átlagát a nyugalmi alapvonallal szembeni aktivitás (1a. kiegészítő ábra), az íztelenséggel szembeni aktivitás (1b. kiegészítő ábra) és az íztelenséggel szembeni aktivitás a valencia regressziójával együtt (1c. kiegészítő ábra). A voxel-specifikus ízhangolás létezésének teszteléséhez minden résztvevő páratlan és páros futásait felosztottuk, összehasonlítva az egyes ízekre vonatkozó voxel-aktivitást a páratlan futásokban az egyes ízekre vonatkozó voxel-aktivitással a páros futásokban. Illusztrációként, amikor a voxeleket az egyes ízekre vonatkozó aktiváció alapján rangsoroltuk a páros futásokban, a páratlan futásokban mind a négy ízre vonatkozóan következetesen csökkenő aktivációs mintázatot találtunk (1b. ábra, 4. kiegészítő ábra). A páratlan és páros futások közötti voxel-aktivációra vonatkozóan korrelációkat számoltunk az egyes résztvevők összes ízkombinációja között, amelyeket egymintás t-próbának vetettünk alá a résztvevők között (1c. ábra, 4a., b. ábra). Továbbá kiszámítottuk a páratlan és páros futások közötti korrelációkat minden egyes résztvevőn belül az azonos és különböző ízkombinációkhoz. A korrelációs együtthatókat z-transzformáltuk, és egymintás t-próbának vetettük alá a résztvevők között (1d ábra, 4b, d ábra).
Keresőfény-elemzés az íz-típusú reprezentációkhoz
Az insuláris kéreg fMRI-adatait a keresőfény (4 mm sugarú, 33 voxelt tartalmazó) elemzés20 segítségével elemeztük. Egy adott gömbön belül minden egyes résztvevő számára egy vektort hoztunk létre, amely az ingerbemutatáshoz időzített BOLD-MRI jel térbeli mintázatát tartalmazza (normalizált t-értékek voxelenként). Annak értékelésére, hogy a keresőgömbökben lévő aktivitási mintázatok képesek-e az íztípusok megkülönböztetésére, egy “leave-one-stimulus-pair-out cross-validation”-t alkalmaztunk40. Ebben az eljárásban az LDA-osztályozót 38 próbán képeztük ki, amelyek a vizsgált íztípust és egy másik íztípust (19 próbát mindegyikre) tartalmaztak, majd a kihagyott ingerpáron teszteltük. Az egyes ízek osztályozási teljesítményét átlagoltuk a más ízekkel való összehasonlításokkal (pl. a savanyú osztályozási teljesítményt átlagoltuk a savanyú vs. édes, savanyú vs. keserű, savanyú vs. sós és savanyú vs. íztelen). Az egyének szintjén az 58,7%-os osztályozási pontosság p < 0,05-nek felelt meg korrigálatlanul. A csoportelemzéshez az egyéni osztályozási teljesítménytérképeket 4 mm FWHM Gauss-kernellel simítottuk, majd egymintás permutációs tesztnek vetettük alá SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm) segítségével. Ebben az eljárásban az egyes résztvevők adatait véletlenszerűen felcseréltük az 50% (véletlen szintű pontosság) levonása után – 1 szorzással, majd egy egymintás t-próbának vetettük alá a résztvevők között. Ezt 10 000-szer permutáltuk, ami az insulán belüli maximális t eloszlást eredményezte. Ennek az eloszlásnak az alapján határoztuk meg az 5%-os FWE küszöbértéket.
íz-kapcsolati elemzés
A több íz-kapcsolati elemzéshez (2b. ábra) minden egyes voxelt arra teszteltünk, hogy meghaladja-e a küszöbértéket a négy íz-típus megkülönböztetésnél, ahol minden íz-típus megkülönböztetés négy összehasonlítás (pl. savanyú vs. édes, savanyú vs. keserű, savanyú vs. sós és savanyú vs. íztelen) osztályozási teljesítményének átlaga meghaladta a véletlenszerű osztályozást (50%). Az érvényes konjunkciós következtetéshez szignifikáns eredményekre van szükség minden összehasonlítás esetében41. Ezért megszámoltuk az 5%-os FWE küszöböt kielégítő íztípusok számát minden egyes voxelben az insulán belül.
Ízpár-elemzés
A specifikus ízpárok elemzéséhez egy egymástól függetlenül meghatározott ROI-t vizsgáltunk az insulán belül. Először egy leave-one-subject-out eljárást alkalmaztunk, kizárva 20 alany mindegyikét, majd a fennmaradó 19 alany esetében kiszámítottuk a 4 ízkapcsolati térképet (azaz a fent leírt mind a 4 ízkontrasztnak megfelelő voxeleket), ami 20 térképet eredményezett. E 20 csoporttérkép átfedése a 2c. ábrán látható. Az 5%-os FWE küszöbértéket kielégítő térkép voxeleit határoztuk meg az ízmegkülönböztetésre képes ROI-ként. Ezen a ROI-n belül megvizsgáltuk az egyes ízpárok megkülönböztetését, kiszámítva az egyes ízpárok osztályozási teljesítményét. A csoportos teljesítményt 20 alany átlagos osztályozási teljesítményeként számoltuk ki (2d. ábra).
A valencia értékelésén alapuló ízpár megkülönböztetéshez (2e. ábra) LDA-elemzést végeztünk a valencia alanyi értékelésének felhasználásával (azaz az fMRI-adatoktól függetlenül). A valenciát úgy számoltuk ki, hogy minden egyes próbára vonatkozóan kivontuk a negativitás értékelését a pozitivitás értékeléséből. Az ízosztályozást egy leave-one-trial-out képzéssel számoltuk ki az egyes íz típusok 19 fennmaradó próbáján.
Valencia és íz típus elemzése
Az íz típus valenciától való függetlenségének teszteléséhez megvizsgáltuk az fMRI adatok hasonlóságát a fenti négy íz konjunkciós térkép által meghatározott ROI-n belül. Minden egyes alany esetében próbánként korrelációkat számoltunk ki, ami 4950 (100 × 99/2) korrelációs együtthatót eredményezett, 2 × 2 kategóriába rendezve az íz típus (azonos, különböző) × hedonikus valencia (azonos, különböző) kategóriákba. A korrelációs együtthatókat minden egyes cellán belül alanyonként átlagoltuk, majd az összes alany adatait kétutas ismételt mérések ANOVA-jának vetettük alá, az íz típusával és a valenciával mint faktorokkal (2g ábra).
Továbbá elvégeztünk egy nyomonkövetési elemzést, amelyben nem volt adatfüggés a kísérletenkénti korrelációkban a 2 × 2 cellák között. Minden egyes cellát véletlenszerűen töltöttünk fel a 100 próbával, és ezt az eljárást 1 000 000 alkalommal megismételtük. Ezek közül azt a permutációt elemeztük, amelynél a 2 × 2 faktorok és a tényleges próbakategóriák között a legnagyobb a kongruencia (a négy cellában a redukált adatok arányának maximális mértani átlaga alapján). Ezután csak az egyes cellákon belül számoltuk ki a kísérletek közötti korrelációkat, biztosítva, hogy ne legyen cella-közi függőség. A korrelációs együtthatókat alanyonként minden egyes cellán belül átlagoltuk, majd az összes fennmaradó alany adatait kétutas ismételt intézkedésekkel végzett ANOVA-nak vetettük alá (3. kiegészítő ábra).
Az íz-típusú minták az ízvalenciától függetlenül különböztek, azaz az ízdiszkriminációs térképek az ízletességtől elválaszthatók voltak. Az íz típus és a valencia közötti erős kapcsolat miatt a próbakombinációk nem voltak egyenlőek az egyes szinteken. Például viszonylag ritkán fordult elő azonos valencia különböző íztípusokkal (4. kiegészítő táblázat). Ez azonban nem jelzi a hatásméret multikollinearitását.
Statisztika
Az adatokat normál eloszlás feltételezése nélkül, nem-paraméteres statisztikával elemeztük. Az ANOVA előtt (2g. ábra) Levene-tesztet végeztünk a homoszkedaszticitás feltételezésének teljesülése érdekében. Többszörös összehasonlítási korrekciókat alkalmaztunk, Bonferroni korrekciót alkalmazva.
Beszámolói összefoglaló
A kísérleti tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.
A cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban.
