A hisztonmódosítás a hisztonfehérjék kovalens poszttranszlációs módosítása (PTM), amely magában foglalja a metilációt, foszforilációt, acetilációt, ubikvitilációt és szumoilációt. A hisztonokon végzett PTM-ek befolyásolhatják a génexpressziót a kromatin szerkezetének megváltoztatásával vagy hisztonmódosítók toborzásával. A hisztonfehérjék feladata, hogy a nyolc hiszton köré tekeredő DNS-t kromoszómákba csomagolják. A hisztonmódosulások különféle biológiai folyamatokban játszanak szerepet, mint például a transzkripciós aktiválás/inaktiválás, a kromoszómacsomagolás és a DNS-károsodás/javítás. A legtöbb fajban a H3 hiszton elsősorban a 9., 14., 18., 23. és 56. lizinben acetilálódik, a 2. argininben és a 4., 9., 27., 36. és 79. lizinben metilálódik, valamint a ser10, ser28, Thr3 és Thr11 foszforilálódik. A H4 hiszton elsősorban az 5., 8., 12. és 16. lizinben acetilálódik, a 3. argininben és a 20. lizinben metilálódik, és az 1. szerinben foszforilálódik. Így a különböző hisztonmódosulások mennyiségi kimutatása hasznos információkkal szolgálna a sejtfolyamatok epigenetikai szabályozásának jobb megértéséhez és a hisztonmódosító enzimekre célzott gyógyszerek kifejlesztéséhez.
Hisztonacetiláció/deacetiláció
A hiszton acetilációja az acetilkoenzim A acetilcsoport (COCH3) enzimatikus hozzáadásával történik. A hiszton acetiláció folyamata szorosan részt vesz számos sejtfolyamat szabályozásában, beleértve a kromatin dinamikáját és a transzkripciót, a géncsendítést, a sejtciklus előrehaladását, az apoptózist, a differenciálódást, a DNS replikációt, a DNS javítást, a nukleáris importot és a neuronális repressziót. A hiszton acetilációban részt vevő módosító enzimeket hiszton acetiltranszferázoknak (HAT) nevezik, és kritikus szerepet játszanak a hiszton H3 és H4 acetiláció szabályozásában. Több mint 20 HAT-ot azonosítottak, amelyek öt családba sorolhatók: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP és nukleáris receptor koaktivátorok, mint például az ACTR.1 A hiszton H3 acetiláció a hiszton deacetilázok (HDAC-ok) gátlásával fokozható, HAT gátlásával pedig csökkenthető.
A hiszton deacetilázok (HDAC-ok) katalizálják az acetilcsoportok hidrolitikus eltávolítását a hiszton lizinmaradékokról. A hiszton acetiláció egyensúlyának felborulását összefüggésbe hozták a tumorigenezissel és a rák progressziójával. Annak kimutatása, hogy a hiszton H3 lizinmaradványainál van-e acetilálva, hasznos információt szolgáltatna az acetilációs minták vagy helyek további jellemzéséhez, ami a génaktiváció epigenetikai szabályozásának jobb megértéséhez, valamint a HAT célzott gyógyszerek kifejlesztéséhez vezetne. A HAT-okhoz hasonlóan a HDAC-ok is kritikus szerepet játszanak a hiszton H3-at és H4-et érintő különböző sejtfolyamatokban. Eddig a HDAC-ok legalább 4 osztályát azonosították. Az I. osztályba tartoznak az 1, 2, 3 és 8 HDAC-ok. A II. osztályba a 4, 5, 6, 7, 9 és 10 HDAC-ok tartoznak. A III. osztályba tartozó, sirtuinok néven ismert enzimek NAD+ kofaktort igényelnek, és ide tartoznak a SIRT 1-7 enzimek. A IV. osztályú enzim, amely csak a HDAC11-et tartalmazza, rendelkezik mind az I., mind a II. osztály jellemzőivel. A HDAC gátlása jelentős hatást mutat az apoptózisra, a sejtciklus leállítására és a rákos sejtek differenciálódására. A HDAC-gátlókat jelenleg rákellenes szerekként fejlesztik.2
Extrahálja a nukleáris fehérjéket a kívánt mintából, majd ELISA-szerű módszerrel mérje a HDAC fehérjék mennyiségét, illetve a HDAC aktivitási szintjét vagy a HAT aktivitási szintjét.
Hisztonmetiláció/Demetiláció
Hisztonmetiláció alatt egy, két vagy három metilcsoport S-adenozil-L-metioninról a hisztonfehérjék lizin- vagy argininmaradványaira történő átvitelét értjük a hiszton-metiltranszferázok (HMT-k) által. A HMT-k a DNS-metilációt kromatinfüggő transzkripciós represszión vagy aktiváláson keresztül ellenőrzik vagy szabályozzák. A sejtmagban, amikor hiszton-metiláció történik, a hisztonnal komplexben lévő DNS-en belüli specifikus gének aktiválódhatnak vagy elnémulhatnak.3 Számos különböző hiszton-metiltranszferáz létezik, amelyek specifikusak az általuk módosított lizin- vagy arginin-maradékra. A H3 hisztonon például a SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx és SMYD3 olyan hiszton-metiltranszferázok, amelyek katalizálják a H3 hiszton metilálását a 4-es lizinben (H3-K4) emlős sejtekben. Az ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 és Eu-HMTase olyan hiszton-metiltranszferázok, amelyek a hiszton H3 9-es lizinnél (H3-K9) történő metilálását katalizálják emlőssejtekben. A G9a és a polikomb-csoport enzimei, mint például az EZH2, olyan hiszton-metiltranszferázok, amelyek a H3-hiszton metilálását a 27-es lizinnél (H3-K27) katalizálják emlőssejtekben.4 Mind a H3-K9, mind a H3-K27 metiláció közvetíti a heterokromatin kialakulását, és részt vesz az euchromatikus helyeken történő génexpresszió elnémításában is. A megnövekedett globális H3-K27 metilációról azt is megállapították, hogy szerepet játszik egyes patológiás folyamatokban, például a rák progressziójában.
Másrészt a H3 és H4 hisztonok arginin-metilációja elősegíti a transzkripciós aktivációt, és a fehérje arginin-metiltranszferázok (PRMT-k) családja közvetíti. Az emberben 9 fajta PRMT található, de csak 7 tagjáról jelentették, hogy metilálja a hisztonokat. Ezek közvetíthetik az arginin-maradványok mono- vagy dimetilálását. A metilcsoport-addíció helyzete alapján a PRMT-ket I-es (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 és PRMT8) és II-es (PRMT5 és PRMT7) típusba sorolhatjuk. A II. típusú PRMT-kről kiderült, hogy erősen érintettek olyan betegségekben, mint a rák.5 Például a PRMT5 szerepet játszik bizonyos tumorszupresszor gének, például az RB tumorszupresszorok elnyomásában, míg a PRMT7 túlterjedése emlőrákban figyelhető meg. A II. típusú PRMT-k, valamint más HMT-k aktivitásának és gátlásának kimutatása fontos lenne a génaktiváció és -csendítés epigenetikai szabályozási mechanizmusainak felderítésében, valamint a rákdiagnosztika és -terápia javára.
Kezdje a hisztonfehérjék izolálásával az érdeklődésre számot tartó mintákból, majd válasszon egy megfelelő ELISA-kitet a hiszton-metilációs szintek kimutatásához.
A hiszton-demetiláció a metilcsoportok eltávolítása a módosított hisztonfehérjékben a hiszton-demetilázok segítségével. Ezek a demetilázok potenciális onkogén funkciókat és más patológiás folyamatokban való részvételt mutattak ki. A hiszton-demetilázok felfedezése azt mutatja, hogy a hiszton-metiláció nem egy állandó módosítás, hanem egy dinamikusabb folyamat. A demetilázok két nagy családját fedezték fel: A lizin specifikus demetiláz 1 (LSD1) és a Jumonji domént tartalmazó (JmjC domén) hiszton demetilázok (JMJD2, JMJD3/UTX és JARIDs). A specifikus aminosavmaradék és a metiláció mértéke határozza meg a demetiláló enzimet. Például a H3 hisztonon a mono- és di-metilált 4-es lizineket az LSD1 (BHC110, KDM1), a tri-metilált 4-es lizint pedig a JARID (1A-1D) demetilálja; a di- és tri-metilált 27 lizint a JMJD3 és az UTX (KDM6A) demetilálja, a mono- és di-metilált 9 lizint pedig a JMJD1, a tri-metilált 9 lizint pedig a JMJD2.6 A hiszton-demetilázok gátlása a kromatin dinamikája és a génexpresszió szempontjából fontos specifikus maradékokon történő hiszton-remetilációhoz vezethet. Ezen túlmenően ezen enzimek aktivitásának és gátlásának kimutatása fontos lenne a génaktiválás és -elnémítás epigenetikai szabályozási mechanizmusainak felderítésében, és előnyös lehet a rákdiagnosztikában és -terápiában.
Vonja ki a nukleáris fehérjéket az Önt érdeklő mintából, majd alkalmazzon egy ELISA-alapú technikát az LSD1 és a JmjC domén családba tartozó hiszton demetilázok aktivitásának és gátlási szintjének vizsgálatára.
Készen áll egy újabb epigenetikai mechanizmus megismerésére? Olvasson tovább! Nem-kódoló RNS
