Vývoj HPLC-MS/MS metody pro stanovení 11 bioaktivních sloučenin v pilulce Tongmai Yangxin a aplikace na farmakokinetickou studii u potkanů

Abstrakt

Byla vyvinuta a validována citlivá a spolehlivá HPLC-MS/MS metoda pro současné stanovení jedenácti bioaktivních sloučenin (rhein, emodinu, stilbenového glykosidu, liquiritinu, ononinu, verbaskosidu, kyseliny gallové, schisandrinu, liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a isoliquiritigeninu) v plazmě potkanů po perorálním podání tabletky Tongmai Yangxin. Odebrané vzorky plazmy byly po okyselení připraveny extrakcí kapalina-kapalina ethylacetátem. Jedenáct sloučenin bylo separováno na koloně CORTECS™ C18 s mobilními fázemi sestávajícími z 0,1% kyseliny mravenčí v deionizované vodě a acetonitrilu. Průtoková rychlost byla 0,3 ml/min. Detekce byla provedena na tandemovém hmotnostním systému se zdrojem ionizace elektrosprejem (ESI) v režimu pozitivní i negativní ionizace s využitím režimu monitorování vícenásobné reakce (MRM). Kalibrační křivky byly lineární v rozsahu 8-2000 ng/ml pro glycyrrhizovou kyselinu; 4-1000 ng/ml pro liquiritin; 0,8-200 ng/ml pro emodin, kyselinu gallovou, ononin, schisandrin a stilbenový glykosid; 0,4-100 ng/ml pro isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein a verbaskosid. Vnitrodenní a mezidenní přesnost analytů byla menší než 9,3 % a 8,5 %. Vnitrodenní a mezidenní přesnost se pohybovala v rozmezí -14,0 % až 10,3 % a -6,5 % až 9,6 %. Mezitím se extrakční výtěžnost analytů ve vzorcích plazmy pohybovala od 85,2 % do 109,1 % a matricový efekt od 89,2 % do 113,4 %. Vyvinutá metoda byla úspěšně aplikována na farmakokinetiku jedenácti bioaktivních látek v plazmě potkanů po perorálním podání Tongmai Yangxin Pill recept.

1. Úvod

Tradiční čínská medicína (TČM) je vzácným pokladem přírody. TCM se používá v klinické praxi již tisíce let a přitahuje stále větší pozornost díky úspěšné léčbě různých onemocnění s minimem vedlejších účinků . Předpis TCM, nejčastěji používaná forma v klinické medicíně, má více složek a více cílů . Vícesložkové a víceúčelové jsou předností a charakteristikou farmakologických účinků TCM .

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) je tradiční čínský patentovaný lék doložený v Čínském lékopise. Recept byl vyvinut ze známé dvojice bylin „GuiZhi-GanCao“ zdokumentované v „Shang-Han-Lun“ Zhongjing Zhangem za dynastie Východní Han. Recept se skládá z jedenácti bylin včetně Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis a Fructus jujubae . TMYX se již několik desetiletí používá k léčbě ischemické choroby srdeční, arytmie, bolesti na hrudi a anginy pectoris . Moderní farmakologické studie ukazují, že TMYX má významný účinek na srdeční onemocnění. Bylo zjištěno, že čtyři aktivní flavonoidní sloučeniny (glyasperin A, glykumarin, licorisoflavan A a likoisoflavon A) z TMYX mají uspokojivou biologickou aktivitu a podporují proliferaci a angiogenezi endoteliálních buněk lidské pupečníkové žíly u zebřiček. . Mezitím Liu a kol. uvedli, že bylo zjištěno, že pět frakcí TMYX vykazuje antiepiteliálně-mezenchymální přechodovou aktivitu . Výsledky Tao naznačily, že šest účinných látek s vysokými hodnotami R (gomisin D, schisandrin, kyselina glycyrrhizová, glykosid stilben, formononetin a ononin) působí protizánětlivě v závislosti na dávce .

Farmakologické účinky TMYX jsou založeny na rozmanitém chemickém složení. Chen uvedl, že pomocí HPLC-MS bylo identifikováno nebo předpokládáno 80 sloučenin, včetně 23 flavonů a jejich glukuronidů, 6 fenetylalkoholových glykosidů, 20 triterpenových saponinů, 15 lignanů a 18 dalších sloučenin . Fan charakterizoval 40 absorbovaných bioaktivních složek po perorálním podání TMYX v séru potkanů pomocí UPLC/Q-TOF-MS . Těchto 40 složek zahrnuje 2 z Radix rehmanniae, 10 z Radix codonopsis, 2 z Radix ophiopogonis, 2 z Ramulus cinnamomi, 19 z Radix glycyrrhizae, 2 z Radix polygoni multiflori preparata, 5 z Caulis spatholobi, 1 z Fructus jujubae a 1 z Fructus schisandrae, z nichž některé se překrývají. Většina složek má protizánětlivé a antioxidační účinky, dále působí kardiovaskulárně ochranně. Tým také stanovuje koncentrace liquiritinu, liquiritigeninu, isoliquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a kyseliny glycyrrhetinové v plazmě potkanů po perorálním podání Radix glycyrrhizae nebo kombinace Radix glycyrrhizae a Ramulus cinnamomi pomocí HPLC-UV. Neexistuje však žádná publikace, která by uváděla farmakokinetickou studii TMYX.

Farmakokinetika (PK) TCM je odvětvím farmakologie TCM. PK TCM se zaměřuje na kvantitativní studium zákonitostí absorpce, distribuce, metabolismu a vylučování léčiv v živém organismu. Studium PK vícesložkových TCM na předpis je jedním z důležitých výzkumných aspektů modernizace TCM. Údaje PK by mohly objasnit látkovou podstatu a odhalit vědecké konotace TCM. Hraje také důležitou roli při tvorbě nových čínských léčiv, zdokonalování lékových forem a mechanismu mechanismu formulace. V této studii byla nejprve vyvinuta spolehlivá a citlivá metoda HPLC-MS/MS, která byla použita k farmakokinetické studii 11 bioaktivních složek včetně rheinu, emodinu, stilbenového glykosidu, liquiritinu, ononinu, verbaskosidu, kyseliny gallové, schisandrinu, liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a isoliquiritigeninu u potkanů po perorálním podání TMYX. Byly zjištěny farmakokinetické charakteristiky hlavních chemických složek TMYX u potkanů, které by poskytly teoretický základ pro použití TMYX v klinické praxi.

2. Experimentální

2.1. Experimentální

2.2. Farmakokinetické vlastnosti TMYX. Chemikálie, činidla a materiály

Methanol (chromatografická čistota) a acetonitril (chromatografická čistota) byly zakoupeny od společnosti Merck Co. Kyselina mravenčí (chromatografická čistota) byla získána od společnosti ROE Co., Ltd. Ultračistá voda byla připravena pomocí systému pro čištění vody Milli-Q (Millipore, Milford, MA, USA). Rhein, emodin, stilbenový glykosid, liquiritin, ononin, verbaskosid, kyselina gallová, schisandrin, liquiritigenin, kyselina glycyrrhizová, isoliquiritigenin a icariin byly zakoupeny od společnosti Chengdu Must Bio-Technology Co. (Chengdu, Čína). TMYX byly dodány společností Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Podmínky chromatografie a hmotnostní spektrometrie

Systém HPLC-MS/MS se skládá z vysoce účinné kapalinové chromatografie Agilent 1200 spojené s hmotnostním spektrometrem Aglient řady 6430 s trojitým kvadrupólem a zdrojem ionizace elektrosprejem (ESI). Chromatografické separace bylo dosaženo na koloně CORTECS C18 (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm) a teplota kolony byla udržována na 30 °C. Mobilní fáze, které se skládaly z 0,1% kyseliny mravenčí ve vodě (A) a acetonitrilu (B), byly použity v následující gradientové eluční metodě: Průtoková rychlost byla nastavena na 0,3 ml/min a injekční objem byl 10 μl. Všechna data byla analyzována pomocí softwaru pracovní stanice Mass Hunter (Agilent Technologies, USA).

Hmotnostní spektrometr pracoval v režimu vícenásobného monitorování reakcí (MRM) s pozitivní i negativní ionizací. Parametry zdroje byly následující: napětí kapiláry nastaveno na 300 V pro režim pozitivní ionizace a -300 V pro režim negativní ionizace, teplota sušícího plynu byla 320 °C, průtok byl 11 l/min a tlak nebulizačního plynu byl 30 psi. Prekurzor a produkce složek a parametry MRM byly zobrazeny v tabulce 1.

2.3. Příprava extraktu TMYX

Extrakt TMYX byl připraven následujícím způsobem: Celkem 100 g prášku TMYX bylo přesně naváženo a dvakrát extrahováno při zpětném toku tepla čtyřnásobným množstvím 60% ethanolu (v/v) vždy po dobu 1 hodiny. Poté byly extrakční roztoky přefiltrovány a smíchány. Smíšený roztok byl zahuštěn odpařením za sníženého tlaku. Poté byly vysušené extrakty rozdrceny na prášek a uchovávány v exsikátoru až do analýzy. Extrakty obsahovaly rhein, emodin, stilbenový glykosid, liquiritin, ononin, verbaskosid, kyselinu gallovou, schisandrin, liquiritigenin, kyselinu glycyrrhizovou a isoliquiritigenin 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 a 9,6 μg/g, v tomto pořadí. Struktury sloučenin ve studii byly uvedeny na obrázku 1.

Obrázek 1

Chemické struktury jedenácti složek.

2.4 Analýza složek. Příprava kalibračních roztoků a kontrolních vzorků kvality

Pro přípravu základního roztoku byly odděleně naváženy rhein, emodin, glykosid stilben, liquiritin, ononin, verbaskosid, kyselina gallová, schisandrin, liquiritigenin, kyselina glycyrrhizová, isoliquiritigenin a icariin (roztok vnitřního standardu) a zředěny methanolem na konečnou koncentraci 1 mg/ml. Směsný standardní roztok byl získán smícháním příslušného objemu jedenácti základních roztoků a zředěním methanolem.

Kalibrační roztoky byly připraveny nasypáním 20 μl směsného standardního roztoku a 20 μl IS do 100 μl slepé krysí plazmy. Konečné koncentrace sériových analytů byly v rozmezí 8-2000 ng/ml pro kyselinu glycyrrhizovou; 4-1000 ng/ml pro liquiritin; 0,8-200 ng/ml pro emodin, kyselinu gallovou, ononin, schisandrin a glykosid stilben; a 0,4-100 ng/ml pro isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein a verbaskosid.

Kvalitní kontrolní vzorky (QC) o třech koncentracích (nízká, střední a vysoká koncentrace) byly sestaveny z příslušných směsných standardních roztoků se slepým vzorkem krve jako kalibrační roztoky, aby byly splněny požadované koncentrace. Všechny roztoky byly uchovávány při teplotě 4 °C.

2.5. Příprava vzorku plazmy

Plazma (100 μl) byla obohacena o 20 μl methanolu, 20 μl IS (icariin, 1 μg/ml) a 20 μl kyseliny mravenčí a poté smíchána vortexem. Směs byla extrahována 800 μl ethylacetátu mícháním vortexem po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Po odstředění při 14 000 ot/min po dobu 10 min byl supernatant odebrán do čisté zkumavky a odpařen do sucha pod proudem dusíku. Zbytek byl rekonstituován v 50 μl 50% methanolu, 5 min vortexován a 10 min centrifugován při 14 000 ot/min. Nakonec bylo 10 μl supernatantu vstříknuto do systému LC-MS/MS pro analýzu.

2.6. Validace metody

2.6.1. Specifičnost

Specifičnost byla hodnocena analýzou slepých vzorků krve od šesti různých potkanů. Každý vzorek plazmy byl vyhodnocen z hlediska endogenních interferencí za použití výše navrženého extrakčního programu a podmínek LC-MS/MS.

2.6.2. Metodika. Linearita a LLOQ

Linearity bylo dosaženo analýzou slepé plazmy potkanů se závažím směsného standardního roztoku a IS ve dvou opakováních během 3 po sobě následujících dnů. Kalibrační křivky byly vyneseny pomocí poměrů plochy píku (y) analytu vůči vnitřnímu standardu v závislosti na nominální koncentraci (x). Váhový faktor je 1/x. Dolní mez stanovitelnosti (LLOQ) byla vyhodnocena podle šumu základní linie, který definuje poměr signál/šum přibližně 10.

2.6.3. Přesnost a správnost

Přesnost a správnost byly hodnoceny stanovením vzorků QC při nízké, střední a vysoké koncentraci (20, 200 a 2000 ng/ml pro kyselinu glycyrrhizovou; 10, 100 a 1000 ng/ml pro liquiritin; 2, 20 a 200 ng/ml pro emodin, kyselinu gallovou, ononin, schisandrin a glykosid stilben; 1, 10 a 100 ng/ml pro isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein a verbaskosid). Všechny koncentrační hladiny byly měřeny v šesti opakováních. Přesnost a správnost byly testovány jednou denně a opakovaně po tři po sobě jdoucí dny se standardní kalibrační křivkou. Vnitrodenní a mezidenní přesnost byla definována jako relativní směrodatná odchylka (RSD), zatímco přesnost byla určena relativní chybou (RE %).

2.6.4. Přesnost a spolehlivost Extrakční výtěžnost a vliv matrice

Extrakční výtěžnost jedenácti analytů na třech koncentračních úrovních a IS byla stanovena porovnáním ploch píků získaných z extrahovaných vzorků s plochami píků vzorků po extrakci. Matricový efekt vzorků a IS byly odhadnuty pomocí poměrů ploch píků analytů v postextrahovaných spikovaných vzorcích k těm, které byly získány z neextrahovaných vzorků. Výtěžnost extrakce i matricový efekt byly testovány v šesti paralelách.

2.6.5. Výtěžnost extrakce i matricový efekt byly testovány v šesti paralelách. Stabilita

Stabilita analytů ve vzorcích plazmy byla stanovena analýzou vzorků QC o třech koncentračních úrovních za různých podmínek: skladování při autosampleru po dobu 12 h, při pokojové teplotě po dobu 6 h, při třech cyklech zmrazování a rozmrazování a skladování při -70 °C po dobu 14 dnů. Všechny studie stability byly měřeny v šesti opakováních.

2.7. Farmakokinetická studie

Samci potkanů Sprague-Dawley (230-250 g) byli získáni od společnosti Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd.. Potkani byli chováni v kontrolovaných podmínkách prostředí a před pokusy byli 12 h nalačno s volným přístupem k vodě. Extrakty TMYX byly rozpuštěny v CMC-Na a podávány potkanům perorálně v dávce 8,3 g/kg. Vzorky krve (200 μl) byly odebrány z žíly fossa orbitalis potkanů v 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 a 48 h po perorálním podání do heparinizovaných zkumavek. A poté byly vzorky krve odstředěny při 7 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut, aby se okamžitě získal vzorek plazmy. Nakonec byla získaná plazma uložena při -70 °C až do analýzy. Farmakokinetické parametry byly vypočteny pomocí počítačového programu „Drug and Statistics 2.0“ (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, Čína).

3. Výsledky a diskuse

3.1. Farmakokinetické parametry a jejich analýza Metoda HPLC-MS/MS

Bylo testováno několik mobilních fází. Ve srovnání s gradientním systémem mobilní fáze acetonitril-voda nebo metanol-voda mohla mobilní fáze obsahující 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě zlepšit tvar píku a zvýšit odezvu signálu analytů. Proto jsme jako mobilní fázi zvolili vodu obsahující 0,1 % kyseliny mravenčí.

Standardní roztoky analytů a vnitřní standard byly vstříknuty do hmotnostního spektrometru, resp. Ononin a schisandrin byly testovány v režimu pozitivních iontů, zatímco ostatní v režimu negativních iontů. Optimalizované přechody mezi prekurzory byly sledovány při 238,9→211,0 pro rhein, 269,0→225,0 pro emodin, 405,2→242,8 pro stilbenový glykosid, 417,1→255,0 pro liquiritin, 431,2→269,1 pro ononin, 623.0→161,1 pro verbaskosid, 169,0→125,1 pro kyselinu gallovou, 433,3→384,2 pro schisandrin, 255,3→119,1 pro liquiritigenin, 821,1→350,5 pro kyselinu glycyrrhizovou, 255,1→118,9 pro isoliquiritigenin a 721,0→513,2 pro IS. Všechny údaje jsou uvedeny v tabulce 1.

3.2. Příprava vzorku

V experimentu jsme testovali dvě metody likvidace vzorku plazmy včetně extrakce kapalina-kapalina (LLE) a srážení bílkovin (PPT). Výsledky ukazují, že výtěžnost i matricové efekty metod splňují požadavky na stanovení biologických vzorků a endogenní látky neinterferují s analýzou. Metoda PPT však vykazovala nižší účinnost extrakce a relativně vyšší matricový efekt. Proto jsme pro přípravu vzorku zvolili extrakci kapalina-kapalina (LLE) s ethylacetátem.

3.3. Extrakce kapalina-kapalina. Validace metody

3.3.1. Specifičnost

Specifičnost byla odhadnuta porovnáním chromatogramů slepých vzorků krve šesti různých potkanů se vzorky krve obsahujícími analyty. Byly zpřístupněny reprezentativní chromatogramy slepého vzorku krve, slepého vzorku krve obsahujícího jedenáct analytů a IS a vzorku plazmy získaného od potkana po perorálním podání extraktů TMYX. Retenční časy rheinu, emodinu, stilbenového glykosidu, liquiritinu, ononinu, verbaskosidu, kyseliny gallové, schisandrinu, liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové, isoliquiritigeninu a IS byly 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 a 12,19 min. Na základě chromatogramů lze konstatovat, že endogenní látky ve vzorcích plazmy neinterferují se stanovením analytů a IS. Chromatogramy jsou znázorněny na obrázku 2.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Obrázek 2

MRM chromatogramy jedenácti analytů. rhein (1), emodin (2), stilbenový glykosid (3), kyselina glycyrrhizová (4), liquiritin (5), liquiritigenin (6), isoliquiritigenin (7), ononin (8), verbaskosid (9), kyselina gallová (10), schisandrin (11) a IS (12). (a) Slepý vzorek plazmy; (b) slepý vzorek plazmy s příměsí analytů a IS; (c) vzorek plazmy po perorálním podání extraktu TMYX.

3.3.2. Linearita a citlivost

Výsledky kalibračních křivek, lineárních rozsahů, korelačních koeficientů a LLOQ byly zobrazeny v tabulce 2. Plazmatické kalibrační křivky byly sestrojeny v rozsahu 8-2000 ng/ml pro kyselinu glycyrrhizovou; 4-1000 ng/ml pro liquiritin; 0,8-200 ng/ml pro emodin, kyselinu gallovou, ononin, schisandrin a glykosid stilben; 0,4-100 ng/ml pro isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein a verbaskosid.

Sloučeniny Kalibrační křivky Korelace koeficienty (r) Lineární rozsah (ng/ml) LLOQ (ng/ml) rhein y = 0.0954 x + 1,5911 0,9966 0,4 – 100 0,4 emodin y = 1,2189 x + 0,0135 0.9906 0,8 – 200 0,8 stilben glykosid y = 6,6409 x + 0,0293 0.9991 0,8 – 200 0,8 kyselina gallová y = 0,9987 x + 0,0104 0,9987 0.8 – 200 0,8 ononin y = 5,4632 x + 0,0058 0,9995 0,8 – 200 0.8 verbaskosid y = 0,3514 x + 1,9984 0,9965 0,4 – 100 0.4 liquiritin y = 1,1970 x + 0,0085 0,9965 4 – 1000 4 schisandrin y = 2.5769 x + 0,0020 0,9980 0,8 – 200 0,8 liquiritigenin y = 2.2148 x + 0,0140 0,9997 0,4 – 100 0,4 kyselina glycyrrhizová y = 0.0917 x – 0,0028 0,9982 8 – 2000 8 isoliquiritigenin y = 3,1496 x + 0,0064 0,9986 0,4 – 100 0.4

Tabulka 2

Kalibrační křivky, korelační koeficienty, lineární rozsahy a LLOQ analytů.

LLOQ pro 11 analytů v plazmatickém vzorku byly nižší než 8 ng/ml, což je dostatečně citlivé pro farmakokinetické studie.

3.3.3. LLOQ pro 11 analytů v plazmatickém vzorku byly nižší než 8 ng/ml, což je dostatečně citlivé pro farmakokinetické studie. Preciznost a přesnost

V této analýze byla analyzována intra- a interdenní preciznost a přesnost na třech koncentračních úrovních v šesti opakováních. Údaje byly zobrazeny v tabulce 3. RSD vnitro- a mezidenní přesnosti se pohybovala mezi 0,7 a 9,3 %. RE přesnosti byla v rozmezí ±14,0 %. Výsledky naznačují, že metoda je přesná a opakovatelná pro analýzu všech analytů v plazmě potkanů.

sloučeniny Nasátá koncentrace (ng/ml) Vnitřní koncentrace (ng/ml).den Inter den Měřená koncentrace (ng/ml) Přesnost (RE, %) Přesnost (RSD, %) Měřená koncentrace (ng/ml) Přesnost (RE, %) Přesnost (RSD, %) rhein 1 1.00±0.01 0.5 1.2 0.99±0.01 -1.0 1.0 10 10.16±0.52 1.6 5.1 10.04±0.34 0.5 3.4 100 106.60±1,52 6,6 1,4 101,83±4,74 1,8 4,7 emodin 2 2,01±0,10 0.3 4.9 2.00±0.05 0.1 2.7 20 21.72±0.57 8.6 2.6 20.47±1.23 2.3 6.0 200 208.21±1.71 4.1 0.8 201.43±8.99 0.7 4.5 stilbenový glykosid 2 1,99±0,06 -0,4 3,0 2,05±0,03 2,3 1.6 20 20.17±0.76 0.8 3.8 19.91±0.73 -0.5 3.7 200 192.33±2,26 -3,8 1,2 192,80±6,57 -3,6 3,4 kyselina galová 2 1,96±0.05 -2.0 2.6 2.06±0.05 3.1 2.4 20 20.00±0.31 0.1 1.6 20.27±0.61 1.4 3.0 200 186.32±1.66 -6.8 0.9 188.68±3.27 -5.7 1,7 onin 2 1,96±0,04 -1,9 2,0 1,95±0,03 -2,6 1.4 20 20.59±0.88 3.0 4.3 19.62±1.09 -1.9 5.6 200 208.21±1,71 4,1 0,8 202,11±5,92 1,1 2,9 verbaskosid 1 0,92±0,01 -7.8 1.5 0.96±0.03 -3.9 3.6 10 9.82±0.36 -1.8 3.7 9.66±0.13 -3.4 1.4 100 102.66±2.89 2.7 2.8 102.03±3.01 2.0 3.0 liquiritin 10 9,45±0,08 -5,5 0,8 9,89±0,49 -1,1 4.9 100 110.26±3.44 10.3 3.1 109.58±2.85 9.6 2.6 1000 1015.89±23,42 1,6 2,3 990,69±29,65 -0,9 3,0 schisandrin 2 2,00±0.04 0.2 2.0 1.89±0.06 -5.4 3.4 20 21.49±0.50 7.5 2.3 20.63±0.70 3.2 3.4 200 199.93±2.23 -0.1 1.1 197.48±3.11 -1,3 1,6 liquiritigenin 1 0,86±0,01 -14,0 1,4 0,93±0,08 -6.5 8.5 10 10.37±0.96 3.7 9.3 9.41±0.50 -5.9 5.3 100 106.60±1,52 6,6 1,4 98,95±7,06 -1,1 7,1 kyselina glycyrrhizová 20 18.72±0.53 -0.1 2.8 19.21±0.49 -4.0 2.6 200 218.30±1.48 0.1 0.7 199.59±15.20 -0.2 7.6 2000 2123.83±59.62 0.1 2.8 1980,71±75,51 -1,0 3,8 isoliquiritigenin 1 0,98±0,02 -2,1 2.1 0.98±0.01 -1.6 1.5 10 9.82±0.14 -1.8 1.5 9.72±0.18 -2.8 1.8 100 99.74±0.87 -0.3 0.9 100.71±3.08 0.7 3.1

Tabulka 3

Přesnost a správnost 11 analytů v plazmě potkanů (n=6).

3.3.4. Přesnost a správnost 11 analytů v plazmě potkanů (n=6). Extrakční výtěžnost a matricový efekt

Všechny údaje o extrakční výtěžnosti a matricovém efektu byly shrnuty v tabulce 4. Extrakční výtěžnost 11 složek na třech koncentračních úrovních byla v rozsahu 85,2-109,1 %. Účinky matrice všech analytů se pohybovaly v rozmezí 89,2-113,4 %. Tyto údaje svědčí o tom, že postup experimentu je účinný a matricové vlivy lze ignorovat.

3.3.5. Stabilita

Pro zkoumání stability analytů byly testovány vzorky QC tří koncentračních úrovní za různých podmínek skladování, včetně skladování v autosampleru po dobu 12 h po přípravě, při pokojové teplotě po dobu 6 h, při třech cyklech zmrazování a rozmrazování a při -70 °C po dobu 14 dnů. Jak ukazuje tabulka 5, výsledky naznačují, že analyty jsou za výše uvedených podmínek stabilní.

Sloučeniny Nasazená koncentrace (ng/ml) pokojová teplota po dobu 6 h tři cykly zmrazování a rozmrazování auto-sampler po dobu 12 h -.70 °C po dobu 14 dnů Měřená koncentrace (ng ml-1) RSD (%) Měřená koncentrace (ng ml-1) RSD (%) Měřená koncentrace (ng ml-1) Měřená koncentrace (ng ml-1) Měřená koncentrace (ng ml-1) Měřená koncentrace (ng ml-1) Koncentrace (ng ml-1) RSD (%) Měřená koncentrace (ng ml-1) RSD (%) rhein 1 0.97±0.02 2.0 0.98±0.03 2.8 0.97±0.01 0.8 0.95±0.05 5.4 10 10.23±0.04 0.4 8.89±0.08 0.9 9.86±0.09 0.9 8.71±0.11 1.3 100 101.97±1.07 1.1 86.7±1.33 1.5 97.32±1.05 1.1 85.95±0.39 0.5 emodin 2 1,95±0,05 2,3 2,00±0,02 0.9 1.93±0.02 0.8 1.86±0.03 1.6 20 21.14±0.99 4.7 19.21±0.33 1.7 19.88±1.81 9.1 18.79±0.18 0.9 200 207.49±1.27 0.6 197.74±5.65 2.9 200.50±11.66 5.8 185.45±0.98 0.5 stilbenový glykosid 2 1,82±0,01 0,8 2.00±0.03 1.6 1.89±0.00 0.1 1.99±0.01 0.3 20 20.88±1.19 5.7 19.87±1.43 7.2 19.00±0.64 3.4 20.01±0.31 1.6 200 202.79±12.80 6.3 200.45±2.10 1.1 182.40±1.23 0.7 203.34±1,39 0,7 kyselina galová 2 1,97±0,03 1.5 1.93±0.04 1.8 2.03±0.05 2.3 1.99±0.04 2.0 20 20.77±1.09 5.3 20.08±0.51 2.5 19.27±0.35 1.8 19.26±0.22 1.2 200 205.97±2.14 1.0 196.77±1.09 0.6 184.54±2.46 1.3 199.19±1,80 0,9 ononin 2 2,02±0,03 1.4 1.85±0.01 0.7 1.83±0.01 0.4 1.95±0.01 0.5 20 20.57±0.26 1.2 18.71±0.26 1.4 18.84±0.62 3.3 18.51±0.15 0.8 200 216.32±0.91 0.4 191.28±2.36 1.2 195.34±4.30 2.2 200,23±3,89 1,9 verbaskosid 1 0,92±0.01 1.0 1.09±0.01 0.9 1.05±0.02 1.8 1.01±0.02 2.3 10 9.57±0.21 2.2 10.17±0.90 8.9 9.50±0.04 0.5 9.81±0.22 2.2 100 103.95±1.33 1.3 108.42±1.17 1.1 93.52±0.27 0,3 107,40±1,47 1,4 liquiritin 10 9.85±0.09 1.0 9.26±0.16 1.7 10.26±0.11 1.1 10.04±0.12 1.2 100 108.97±1.51 1.4 109.67±1.86 1.7 108.02±0.66 0.6 105.05±1.73 1.7 1000 1076.07±10.27 1.0 952.89±11.22 1.2 869.12±14.52 1.7 1021.69±19.98 2.0 schisandrin 2 2,00±0,04 1,8 1,71±0,01 0.6 1.83±0.02 1.1 1.77±0.03 1.7 20 21.15±0.50 2.4 18.28±0.23 1.2 18.35±0.09 0.5 17.86±0.20 1.1 200 194.61±1.13 0.6 189.32±1.74 0.9 196.02±2.10 1.1 183.83±1.00 0.6 liquiritigenin 1 0,87±0,01 0,9 0,89±0,02 1.8 0.87±0.01 1.1 0.88±0.02 2.1 10 10.82±0.58 5.3 8.99±0.07 0.8 8.63±0.23 2.7 9.26±0.08 0.9 100 112.69±1.30 1.2 92.59±0.63 0.7 92.65±0.68 0.7 91.88±0.86 0.9 kyselina glycyrrhizová 20 20,49±0,79 3,9 19.30±0.20 1.0 19.25±0.34 1.8 18.77±0.09 0.5 200 203.22±3.32 1.6 188.63±3.57 1.9 200.96±3.93 2.0 200.33±2.98 1.5 2000 2099.10±8.92 0.4 1869.00±42.55 2.3 1884.66±9.26 0.5 1834.54±29,34 1,6 isoliquiritigenin 1 0,99±0.01 1.5 0.89±0.02 2.4 1.00±0.02 1.7 0.89±0.01 1.4 10 10.86±0.60 5.5 8.69±0.14 1.6 9.60±0.04 0.4 8.62±0.04 0.4 100 106.11±0.78 0.7 100.58±0.91 0.9 97.47±1.99 2.0 100,74±2,95 2,9

Tabulka 5

Stabilita všech analytů v plazmě potkanů (n=6). Farmakokinetická studie

Validovaná metoda LC-MS/MS byla použita k farmakokinetické studii jedenácti analytů ve vzorku krve potkanů po perorálním podání TMYX v jednorázové dávce 8,3 g/kg. Hlavní farmakokinetické parametry jsou uvedeny v tabulce 6. A průměrné plazmatické koncentrační časové profily jedenácti účinných látek byly uvedeny na obrázku 3.

Složky Tmax1 (h) Tmax2 (h) Cmax1 (ng/ml) . Cmax2 (ng/ml) t1/2 (h) Ke (1/h) (h-ng/ml) (h-ng/ml) rhein 0.36±0.31 46.3±15.6 2.84±2.13 0.56±0.50 145.0±52,6 152,1±61,3 emodin 0,32±0,14 88.0±37.5 4.21±2.63 0.39±0.28 475.5±121.0 561.3±192,3 stilbenový glykosid 0,50±0,31 99.1±27.1 1.99±1.31 0.45±0.24 283.8±189.1 297.5±185,3 liquiritin 0,50±0,46 199,9±120.2 2.16±1.44 0.77±0.54 637.2±220.2 651.1±219.5 ononin 0,46±0,10 14,4±6,8 2.85±1,40 0,37±0,25 58,2±20,2 69,4±28,5 verbaskosid 0.37±0.18 23.4±8.7 1.53±0.67 0,56±0,31 51,4±29,8 61,0±29,8 kyselina gallová 0.75±0.67 56.9±42.8 3.01±1.35 0.27±0.12 214,7±136,7 238,4±172,8 schisandrin 1,00±0.92 92.6±53.0 2.73±1.54 0.34±0.19 410.8±238,9 473,4±321,2 liquiritigenin 0,20±0,07 7.20±3.35 37.8±24.1 21.0±15.3 12.70±7.04 0.50±0.34 314,8±129,8 332,6±142,1 kyselina glycyrrhizová 2,13±1.44 17.67±10.31 351.7±347.4 476.1±146.0 18.19±9.61 0.05±0,03 12743,5±5058,2 17327,3±10967,3 isoliquiritigenin 0.28±0.11 7.00±2.45 41.6±24.2 24.9±13.5 13.46±8.33 0.07±0.04 410.0±130.7 436.2±154.1

Tabulka 6

Farmakokinetické parametry 11 analytů po perorálním podání extraktu TMYX (n=6).

Obrázek 3

Křivky střední plazmatické koncentrace v čase pro rhein, emodin, glykosid stilben, liquiritinu, ononinu, verbaskosidu, kyseliny gallové, schisandrinu, liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a isoliquiritigeninu po perorálním podání extraktu TMYX (průměr ± SD, n=6).

Tmax rheinu, emodinu, glykosidu stilbenu, liquiritinu, ononinu, verbaskosidu, kyseliny gallové a schisandrinu je 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h a 1,00±0,92 h. Tmax ukazuje, že osm složek se rychle vstřebává. Dvojité píky jsou zjištěny v průměrných profilech plazmatické koncentrace v čase u liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a isoliquiritigeninu. První pík tří složek se objevil v 0,20 h, 2,13 h a 0,28 h a druhý pík v 7,20 h, 17,67 h a 7,00 h v uvedeném pořadí. Mohl by být důsledkem hepatoenterální cirkulace. Po perorálním podání Radix glycyrrhizae nebo kombinace Radix glycyrrhizae a Ramulus cinnamomi byl v plazmě potkanů zaznamenán jeden vrchol plazmatického koncentračního časového profilu liquiritigeninu, isoliquiritigeninu a kyseliny glycyrrhizové . Rozdíly mohou pocházet z účinků dalších bylin v TMYX, které vyžadují další experiment. Kromě dvojitých píků se poločasy eliminace (t1 /2) rheinu, emodinu, kyseliny gallové, glycyrrhizinu, glykosidu stilbenu, verbaskosidu, formononetinu a schisandrinu pohybují v rozmezí od 1,53 h do 4,21 h, což naznačuje, že těchto osm analytů je ve vzorku krve potkanů po perorálním podání rychle eliminováno. Podobný farmakokinetický trend schisandrinu byl zaznamenán po perorálním podání vodného extraktu Fructus schisandrae . Bylo také zaznamenáno, že jeden pík byl pozorován u emodinu a kyseliny gallové u potkanů, kterým byl podán zpracovaný Radix polygoni multiflori . Hodnoty t1 /2 liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a isoliquiritigeninu jsou 12,70 h, 18,19 h a 13 h.46 h, což naznačuje, že složka má delší dobu působení, zejména isoliquiritigenin a kyselina glycyrrhizová, které lze in vivo detekovat ještě po 48 h.

4. Závěr

V našem experimentu jsme vyvinuli metodu HPLC-MS/MS pro detekci rheinu, emodinu, glykosidu stilbenu, liquiritinu, ononinu, verbaskosidu, kyseliny gallové, schisandrinu, liquiritigeninu, kyseliny glycyrrhizové a isoliquiritigeninu v plazmě potkanů. Farmakokinetické parametry by byly užitečné pro další vývoj a klinické použití TMYX. Údaje o 11 účinných látkách přípravku TMYX, které se vstřebávaly do plazmy, by poskytly podporu pro zlepšení kontroly kvality.

Dostupnost údajů

Údaje použité na podporu výsledků této studie jsou na vyžádání k dispozici u příslušného autora.

Konflikty zájmů

Autoři prohlašují, že neexistují žádné střety zájmů.

Poděkování

Tato studie byla podpořena National Natural Science Foundation of China (81673824 a 81503457) a Tianjin Municipal Education Commission Research Project (2017KJ139).