Desenvolvimento de um método HPLC-MS/MS para determinar 11 compostos bioativos na pílula Yangxin Tongmai e aplicação a um estudo farmacocinético em ratos

Abstract

Um método HPLC-MS/MS sensível e confiável foi desenvolvido e validado para a determinação simultânea de onze compostos bioativos (rhein, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascoside, ácido gálico, schisandrin, liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina) no plasma de rato após a administração oral da pílula Tongmai Yangxin. As amostras de plasma coletadas foram preparadas por extração líquido-líquido com acetato de etila após a acidificação. Onze compostos foram separados em uma coluna CORTECS™ C18 com fases móveis consistindo de 0,1% de ácido fórmico em água deionizada e acetonitrila. A vazão foi de 0,3 mL/min. A detecção foi realizada em um sistema de massa em tandem com uma fonte de ionização por eletroospray (ESI), tanto em modo de ionização positiva quanto negativa, utilizando o modo de monitoramento de múltiplas reações (MRM). As curvas de calibração foram lineares na faixa de 8-2000 ng/mL para ácido glicirrízico; 4-1000 ng/mL para liquiritina; 0,8-200 ng/mL para emodina, ácido gálico, ononina, cisandrina e glicosídeo estilbeno; 0,4-100 ng/mL para isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascosídeo, respectivamente. A precisão intra e inter-dia dos analitos foi inferior a 9,3% e 8,5%. A precisão intra e inter-dia estava na faixa de -14,0% a 10,3% e -6,5% a 9,6%. Entretanto, a recuperação da extração dos analitos em amostras de plasma variou de 85,2% a 109,1% e o efeito matriz de 89,2% a 113,4%. O método desenvolvido foi aplicado com sucesso na farmacocinética de onze compostos bioativos no plasma de ratos após a administração oral da pílula Yangxin de Tongmai.

1. Introdução

A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) é um tesouro precioso da natureza. As MTCs têm sido usadas na clínica por milhares de anos e atraem atenções crescentes devido ao tratamento de diversas doenças com o mínimo de efeitos colaterais. A prescrição de MTC, a forma mais comumente usada na medicação clínica, tem multicomponentes e multi-alvos . Os multicomponentes e os múltiplos alvos são superioridade e característica das ações farmacológicas da MTC .

Pílula de Yangxin Tongmai (TMYX) é uma medicina tradicional chinesa patenteada documentada na Farmacopéia Chinesa. A prescrição foi desenvolvida a partir de um conhecido par de ervas “GuiZhi-GanCao” documentado em “Shang-Han-Lun” por Zhongjing Zhang na Dinastia Han Oriental. A receita consiste em onze ervas incluindo Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis, e Fructus jujubae . TMYX tem sido usado para tratar doenças coronárias, arritmia, dores no peito e angina há várias décadas. Estudos farmacológicos modernos mostram que o TMYX tem um efeito significativo nas doenças cardíacas. Quatro compostos flavonóides ativos (glicosperina A, glicocumarina, licorisoflavan A e licoisoflavona A) da TMYX tiveram atividade biológica satisfatória e promovem a proliferação e angiogênese das células endoteliais das veias umbilicais humanas em zebrafish. Entretanto, Liu et al. relataram que cinco frações de TMYX foram encontradas para exercer atividade de transição antiepitelial-mesenchimal. Os resultados de Tao indicaram que seis princípios ativos com altos valores de R (gomisina D, cisandrina, ácido glicirrízico, glicósido estilbeno, formononetina e ononina) exercem efeitos antiinflamatórios de forma dose-dependente .

Os efeitos farmacológicos do TMYX são baseados na composição química diversa. Chen relatou que 80 compostos foram identificados ou supostos usando HPLC-MS, incluindo 23 flavonas e seus glucuronídeos, 6 glicosídeos de álcool fenetílico, 20 saponinas triterpeno, 15 lignanos e 18 outros compostos . O ventilador caracterizou 40 componentes bioativos absorvidos após a administração oral de TMYX em soro de rato por UPLC/Q-TOF-MS . Os 40 componentes incluindo 2 de Radix rehmanniae, 10 de Radix codonopsis, 2 de Radix ophiopogonis, 2 de Ramulus cinnamomi, 19 de Radix glycyrrhizae, 2 de Radix polygoni multiflori preparata, 5 de Caulis spatholobi, 1 de Fructus jujubae e 1 de Fructus schisandrae, alguns dos quais estão sobrepostos. A maioria dos ingredientes exercem efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes, além de exercerem o efeito protector cardiovascular. A equipe também determina as concentrações de liquiritina, liquiritigenina, isoliquiritigenina, ácido glicirrízico e ácido glicirretínico no plasma de ratos após a administração oral de Radix glycyrrhizae ou a combinação de Radix glycyrrhizae e Ramulus cinnamomi por HPLC-UV. No entanto, não há nenhuma publicação que reporte o estudo farmacocinético de TMYX.

Farmacocinética (PK) de MTC é um ramo da farmacologia das MTCs. PK de MTC concentra-se no estudo quantitativo das leis de absorção, distribuição, metabolismo e excreção de drogas em um organismo vivo. O estudo PK de multicomponentes da prescrição de MTC tem sido um dos importantes aspectos de pesquisa da modernização das MTCs. Os dados de PK poderiam elucidar a base da substância e revelar a conotação científica das MTCs. Também desempenha um papel importante na criação de novos medicamentos chineses, na melhoria das formas de dosagem e no mecanismo de formulação. No presente estudo, um método HPLC-MS/MS confiável e sensível foi inicialmente desenvolvido e aplicado ao estudo farmacocinético de 11 componentes bioativos incluindo reina, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascoside, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina em ratos após a administração oral de TMYX. As características farmacocinéticas dos principais componentes químicos do TMYX em ratos foram reveladas, o que forneceria uma base teórica para o uso de TMYX na clínica.

2. Experimental

2.1. Químicos, Reagentes e Materiais

Metanol (pureza cromatográfica) e acetonitrilo (pureza cromatográfica) foram adquiridos da Merck Co., Ltd. O ácido fórmico (pureza cromatográfica) foi obtido da ROE Co., Ltd. Água ultra-pura foi preparada com um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Milford, MA, EUA). Rhein, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascosido, ácido gálico, schisandrin, liquiritigenina, ácido glicirrízico, isoliquiritigenina e icariina foram adquiridos da Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). TMYX foram fornecidos pela Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Condições cromatográficas e de espectrometria de massa

O sistema HPLC-MS/MS consiste de uma cromatografia líquida de alto desempenho Agilent 1200 acoplada a um espectrômetro de massa quadripolar triplo Aglient série 6430 com uma fonte de ionização de eletroospray (ESI). A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna CORTECS C18 (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), e a temperatura da coluna foi mantida a 30°C. As fases móveis que consistiram de ácido fórmico 0,1% em água (A) e acetonitrilo (B) foram utilizadas no seguinte método de eluição de gradiente: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. A vazão foi fixada em 0,3 mL/min, e o volume de injeção foi de 10 μL. Todos os dados foram analisados pelo software Mass Hunter (Agilent Technologies, EUA).

O espectrômetro de massa foi realizado tanto no modo de monitoramento de ionização múltipla (MRM) positivo como negativo. Os parâmetros da fonte foram os seguintes: a tensão capilar fixada em 300 V para o modo de ionização positiva e -300 V para o modo de ionização negativa, a temperatura do gás de secagem foi de 320°C, o fluxo foi de 11 L/min e a pressão do gás de nebulização foi de 30 psi. O precursor e a produção dos ingredientes e parâmetros MRM foram exibidos na Tabela 1.

2.3. TMYX Extract Preparation

TMYX extract foi preparado como se segue: Um total de 100 g de pó de TMYX foi pesado com precisão e extraído duas vezes sob refluxo de calor por quatro vezes a quantidade de 60% de etanol (v/v) durante 1 h por vez. Depois disso, as soluções de extracção foram filtradas e misturadas. A solução misturada foi concentrada por evaporação sob pressão reduzida. Em seguida, os extratos secos foram triturados em pó e mantidos em um dessecador até a análise. Os extratos contêm reina, emodina, estilbeno glicósido, liquiritina, ononina, verbascosido, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 e 9,6 μg/g, respectivamente. As estruturas dos compostos no estudo foram mostradas na Figura 1.

Figura 1

>Estruturas químicas de onze componentes.

2.4. Soluções de Calibração e Preparação de Amostras de Controle de Qualidade

Para fazer a solução de reserva, reina, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascoside, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrízico, isoliquiritigenina e icariina (solução padrão interno) foram pesadas separadamente e diluídas com metanol a uma concentração final de 1 mg/mL. A solução padrão mista foi obtida através da mistura de um volume adequado de onze soluções de reserva e diluída com metanol.

As soluções de calibração foram preparadas através do pico de 20 μL da solução padrão da mistura e 20 μL de IS em 100 μL de plasma de rato em branco. As concentrações finais dos analitos da série estavam na faixa de 8-2000 ng/mL para ácido glicirrízico; 4-1000 ng/mL para liquiritina; 0,8-200 ng/mL para emodina, ácido gálico, ononina, esquisandrina e glicosídeo estilbeno; e 0,4-100 ng/mL para isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascosídeo.

Amostras de controle de qualidade (QC) em três concentrações (baixa, média e alta concentração) foram compostas de soluções padrão misturadas apropriadas com amostra de sangue branco como soluções de calibração para atender às concentrações requeridas. Todas as soluções foram mantidas a 4°C.

2,5. Preparação da amostra de plasma

O plasma (100 μL) foi perfurado com 20 μL de metanol, 20 μL de IS (icariina, 1 μg/mL), e 20 μL de ácido fórmico e depois vortex-mixed. A mistura foi extraída com 800 μL de acetato de etilo por mistura em vortex durante 5 min à temperatura ambiente. Após centrifugação a 14.000 rpm durante 10 min, o sobrenadante foi coletado para um tubo limpo e evaporado até secar sob um fluxo de nitrogênio. O resíduo foi reconstituído em 50 μL de metanol a 50%, vortexado durante 5 min e centrifugado a 14.000 rpm durante 10 min. Finalmente, 10 μL de sobrenadante foi injetado no sistema LC-MS/MS para análise.

2,6. Validação do Método

2.6.1. Especificidade

A especificidade foi avaliada analisando amostras de sangue em branco de seis ratos diferentes. Cada amostra de plasma foi avaliada para interferência endógena usando o programa de extração sugerido e as condições LC-MS/MS acima.

2.6.2. Linearidade e LLOQ

A linearidade foi alcançada através do ensaio de plasma de ratos em branco com uma solução padrão mista e IS em duplicado durante 3 dias consecutivos. As curvas de calibração foram traçadas pelas razões de área de pico (y) do analito em relação ao padrão interno versus a concentração nominal (x). O fator de peso é 1/x. O limite inferior de quantificação (LLOQ) foi avaliado de acordo com o ruído da linha base, definindo uma relação sinal/ruído de cerca de 10,

2,6,3. Precisão e Precisão

A precisão e exatidão foram avaliadas pela determinação de amostras de QC em níveis de baixa, média e alta concentração (20, 200, e 2000 ng/mL para o ácido glicirrízico; 10, 100 e 1000 ng/mL para liquiritina; 2, 20 e 200 ng/mL para emodina, ácido gálico, ononina, cisandrina e glicosídeo estilbeno; 1, 10 e 100 ng/mL para isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascosídeo). Todos os níveis de concentração foram medidos em seis réplicas. A precisão e exatidão foram testadas uma vez por dia e repetidas por 3 dias consecutivos com a curva de calibração padrão. A precisão intra- e inter-dia foi definida como o desvio padrão relativo (RSD), enquanto a precisão foi determinada pelo erro relativo (RE %).

2.6.4. Extraction Recovery and Matrix Effect

A recuperação de extracção de onze analitos a três níveis de concentração e EI foram testados comparando as áreas de pico obtidas das amostras extraídas com as das amostras pós-extraídas. O efeito matricial das amostras e EI foi estimado pela relação entre as áreas dos picos das amostras pós-extraídas e aquelas obtidas de amostras não-extraídas. Tanto a recuperação da extracção como o efeito matriz foram testados em seis paralelos.

2,6,5. Estabilidade

A estabilidade dos analitos em amostras de plasma foi determinada pela análise de amostras de QC de três níveis de concentração em condições diferentes: armazenadas em auto amostrador por 12 h, à temperatura ambiente por 6 h, sob três ciclos de congelamento-descongelamento e armazenadas a -70°C por 14 dias. Todos os estudos de estabilidade foram medidos em seis réplicas.

2,7. Estudo farmacocinético

Ratos Sprague-Dawley machos (230-250 g) foram obtidos de Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd. Os ratos foram mantidos sob condições ambientais de controle e jejuaram por 12 h com livre acesso à água antes dos experimentos. Os extratos de TMYX foram dissolvidos em CMC-Na e administrados oralmente a ratos a 8,3 g/kg. As amostras de sangue (200 μL) foram coletadas da veia orbitalis da fossa de rato a 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 e 48 h após a administração oral a tubos heparinizados. E então as amostras de sangue foram centrifugadas a 7.000 rpm durante 10 min para obter a amostra de plasma imediatamente. Finalmente, o plasma obtido foi armazenado a -70°C até a análise. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados pelo programa de computador “Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Faculdade de Medicina de Wannan, China).

3. Resultado e Discussão

3.1. Método HPLC-MS/MS

Fases móveis transversais foram testadas. Comparando com um sistema de fase móvel gradiente com acetonitrilo-água ou metanol-água, a fase móvel contém 0,1% de ácido fórmico em água que poderia melhorar a forma do pico e aumentar a resposta do sinal dos analitos. Assim, escolhemos a água contendo 0,1% de ácido fórmico como a fase móvel.

As soluções padrão de analitos e padrão interno foram injetadas no espectrômetro de massa, respectivamente. A ononina e a schisandrina foram testadas em modo iônico positivo, enquanto outras foram testadas em modo negativo. As transições otimizadas de precursor para produção foram monitoradas em 238.9→211.0 para reina, 269.0→225.0 para emodina, 405.2→242.8 para glicósido estilbeno, 417.1→255.0 para liquiritina, 431.2→269.1 para ononina, 623.0→161.1 para verbascoside, 169.0→125.1 para ácido gálico, 433.3→384.2 para esquisandrina, 255.3→119.1 para liquiritigenina, 821.1→350.5 para ácido glicirrízico, 255.1→118.9 para isoliquiritigenina, e 721.0→513.2 para SI. Todos os dados foram mostrados na Tabela 1.

3.2. Preparação da amostra

No experimento, testamos dois métodos para eliminar a amostra de plasma incluindo extração líquido-líquido (LLE) e precipitação de proteínas (PPT). Os resultados mostram que tanto a recuperação como os efeitos matriciais dos métodos satisfazem os requisitos para a determinação das amostras biológicas e as substâncias endógenas não interferem com a análise. No entanto, o método de PPT mostrou menor eficiência de extracção e maior efeito matricial relativamente. Consequentemente, selecionamos a extração líquido-líquido (LLE) com acetato de etila para preparar a amostra.

3,3. Validação do Método

3,3.3.1. Especificidade

A especificidade foi estimada comparando cromatogramas de amostras de sangue em branco de seis ratos diferentes com amostras de sangue contendo analitos. Foram acessados os cromatogramas representativos de amostra de sangue branco, amostra de sangue branco contendo onze análises e EI, e amostra de plasma obtida de um rato após a administração oral de extratos de TMYX. O tempo de retenção de reina, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascoside, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrízico, isoliquiritigenina e EI foi de 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41, e 12,19 min, respectivamente. Com base nos cromatogramas, as substâncias endógenas nas amostras de plasma não interferem na determinação dos analitos e da EI. Os cromatogramas foram mostrados na Figura 2.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

Cromatogramas de MRM de onze analitos. reina (1), emodina (2), glicosídeo estilbeno (3), ácido glicirrízico (4), liquiritina (5), liquiritigenina (6), isoliquiritigenina (7), ononina (8), verbascosídeo (9), ácido gálico (10), cisandrina (11), e EI (12). (a) Plasma em branco; (b) Plasma em branco com os analitos e EI; (c) amostra de plasma após administração oral de extrato de TMYX.

3.3.2. Linearidade e Sensibilidade

Os resultados das curvas de calibração, faixas lineares, coeficientes de correlação e LLOQs foram exibidos na Tabela 2. As curvas de calibração de plasma foram construídas dentro da faixa de 8-2000 ng/mL para ácido glicirrízico; 4-1000 ng/mL para liquiritina; 0,8-200 ng/mL para emodina, ácido gálico, ononina, cisandrina e glicosídeo estilbeno; 0,4-100 ng/mL para isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascosídeo.

Os LLOQs de 11 analitos em amostra de plasma eram inferiores a 8 ng/mL, que são sensíveis o suficiente para os estudos farmacocinéticos.

3.3.3. Precisão e Precisão

Neste ensaio, a precisão e exatidão intra e inter-dia foram analisadas em três níveis de concentração em seis réplicas. Os dados foram apresentados na Tabela 3. As DER de precisão intra e inter-dia estavam entre 0,7 e 9,3%. O RE de precisão estava dentro de ±14,0%. Os resultados sugerem que o método é preciso e repetível para análise de todos os analitos no plasma de ratos.

3.3.4. Recuperação da Extracção e Efeito Matriz

Todos os dados da recuperação da extracção e efeito matriz foram resumidos na Tabela 4. A recuperação da extração de 11 ingredientes, em três níveis de concentração, foi no escopo de 85,2-109,1%. Os efeitos matriciais de todos os analitos variaram de 89,2 a 113,4%. Os dados que manifestam o procedimento do experimento são eficientes e os efeitos matriciais podem ser ignorados.

3.3.5. Estabilidade

Para investigar a estabilidade dos analitos, foram testadas amostras de QC de três níveis de concentração sob as diferentes condições de armazenamento, incluindo armazenamento em auto-amplificador durante 12 h após a preparação, à temperatura ambiente durante 6 h, em três ciclos de congelamento-descongelamento e a -70°C durante 14 dias. Como mostrado na Tabela 5, os resultados sugerem que os analitos são estáveis nas condições acima.

3,4. Estudo farmacocinético

O método LC-MS/MS validado foi aplicado ao estudo farmacocinético dos onze analitos na amostra de sangue de rato após administração oral de TMYX a uma dose única de 8,3 g/kg. Os principais parâmetros farmacocinéticos foram demonstrados na Tabela 6. E os perfis médios de concentração plasmática dos onze princípios ativos foram mostrados na Figura 3.

Figura 3

Curvas de tempo de concentração plasmática média de reina, emodina, estilbene glicósido, liquiritina, ononina, verbascosida, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina após administração oral de extrato de TMYX (média ± SD, n=6).

O Tmax de reina, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascoside, ácido gálico e cisandrina são 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h, e 1,00±0,92 h, respectivamente. O Tmax mostra que oito ingredientes são absorvidos rapidamente. Os picos duplos são detectados nos perfis de concentração plasmática média de liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina. O primeiro pico de três ingredientes apareceu às 0,20 h, 2,13 h e 0,28 h e o segundo pico às 7,20 h, 17,67 h e 7,00 h, respectivamente. Pode resultar da circulação hepatoenteral. Um pico de concentração plasmática de liquiritigenina, isoliquiritigenina e ácido glicirrízico foram relatados no plasma de rato após a administração oral de Radix glycyrrhizae ou a combinação de Radix glycyrrhizae e Ramulus cinnamomi . As diferenças podem vir dos efeitos de outras ervas em TMYX que requerem mais experimentos. Além dos picos duplos, a meia-vida de eliminação (t1 /2) da reina, emodina, ácido gálico, glicirrizina, glicosídeo estilbeno, verbascosídeo, formononetina e cisandrina varia de 1,53 h a 4,21 h, o que sugere que esses oito analitos na amostra de sangue de rato são eliminados rapidamente após a administração oral. A tendência farmacocinética similar da cisandrina foi relatada após a administração oral do extrato aquoso de Fructus schisandrae. Também foi relatado que um pico foi observado para emodina e ácido gálico em ratos dosados processados com Radix polygoni multiflori . O t1 /2 da liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina são 12,70 h, 18,19 h, e 13.46 h, o que indica que o ingrediente tem um tempo de tratamento mais longo, especialmente isoliquiritigenina e ácido glicirrízico, que ainda pode ser detectado in vivo às 48 h.

4. Conclusão

Em nossa experiência, desenvolvemos um método de HPLC-MS/MS para detectar a reina, emodina, glicósido estilbeno, liquiritina, ononina, verbascoside, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrízico e isoliquiritigenina no plasma de ratos. Os parâmetros farmacocinéticos seriam úteis para o desenvolvimento e uso posterior na clínica do TMYX. Os 11 ingredientes ativos de TMYX, que foram absorvidos no plasma, forneceriam suporte de dados para a melhoria do controle de qualidade.

Dados disponíveis

Os dados usados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente, mediante solicitação.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

Acreditos

Este estudo foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81673824 e 81503457) e pelo Projeto de Pesquisa da Comissão Municipal de Educação de Tianjin (2017KJ139).