Udvikling af en HPLC-MS/MS-metode til bestemmelse af 11 bioaktive forbindelser i Tongmai Yangxin-piller og anvendelse til en farmakokinetisk undersøgelse hos rotter

Abstract

En følsom og pålidelig HPLC-MS/MS-metode er blevet udviklet og valideret til samtidig bestemmelse af elleve bioaktive forbindelser (rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre og isoliquiritigenin) i rotteplasma efter oral indgift af Tongmai Yangxin-piller. De indsamlede plasmaprøver blev fremstillet ved væske-væskeekstraktion med ethylacetat efter syretilsætning. Elleve forbindelser blev separeret på en CORTECS™ C18-kolonne med mobile faser bestående af 0,1 % myresyre i deioniseret vand og acetonitril. Strømningshastigheden var 0,3 mL/min. Detektionen blev udført på et tandem-massesystem med en elektrospray-ioniseringskilde (ESI) i både positiv og negativ ionisering ved hjælp af MRM-tilstand (multiple-reaction monitoring). Kalibreringskurverne var lineære i intervallet 8-2000 ng/mL for glycyrrhizinsyre; 4-1000 ng/mL for liquiritin; 0,8-200 ng/mL for emodin, gallinsyre, ononin, schisandrin og stilbenglycosid; 0,4-100 ng/mL for henholdsvis isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein og verbascosid. Intra- og interdagspræcisionen for analyterne var mindre end 9,3 % og 8,5 %. Intra- og interdagspræcisionen lå i intervallet -14,0 % til 10,3 % og -6,5 % til 9,6 %. I mellemtiden varierede ekstraktionsgenoprettelsen af analytterne i plasmaprøver fra 85,2 % til 109,1 % og matrixeffekten fra 89,2 % til 113,4 %. Den udviklede metode blev med succes anvendt til farmakokinetik af elleve bioaktive forbindelser i rotteplasma efter oral indgivelse af Tongmai Yangxin-piller på recept.

1. Indledning

Traditionel kinesisk medicin (TCM) er en dyrebar skat af naturen. TCM har været anvendt i klinisk brug i tusindvis af år og tiltrækker stigende opmærksomhed på grund af den vellykkede behandling af forskellige sygdomme med minimale bivirkninger . TCM-ordinationer, der er den mest almindeligt anvendte form for klinisk medicinering, har flere komponenter og flere mål . Multikomponenterne og multitargets er overlegenhed og karakteristiske for TCM’s farmakologiske virkninger.

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) er en traditionel kinesisk patentmedicin, der er dokumenteret i den kinesiske farmakopé. Recepten blev udviklet ud fra et velkendt urtepar “GuiZhi-GanCao”, der er dokumenteret i “Shang-Han-Lun” af Zhongjing Zhang i det østlige Han-dynasti. Recepten består af elleve urter, herunder Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis, og Fructus jujubae . TMYX har været anvendt til behandling af koronar hjertesygdom, arytmi, brystsmerter og angina pectoris i flere årtier . Moderne farmakologiske undersøgelser viser, at TMYX har en betydelig virkning på hjertesygdomme. Fire aktive flavonoidforbindelser (glyasperin A, glycycoumarin, licorisoflavan A og licoisoflavon A) fra TMYX viste sig at have tilfredsstillende biologisk aktivitet og fremme proliferation og angiogenese af menneskelige endotelceller fra navlebenet i zebrafisk . I mellemtiden rapporterede Liu et al., at fem fraktioner af TMYX viste sig at udøve en antipithelial-mesenchymal overgangsaktivitet . Taos resultater viste, at seks aktive ingredienser med høje R-værdier (gomisin D, schisandrin, glycyrrhizinsyre, stilben glycosid, formonononetin og ononin) udøver antiinflammatoriske virkninger på en dosisafhængig måde .

De farmakologiske virkninger af TMYX er baseret på den forskelligartede kemiske sammensætning. Chen rapporterede 80 forbindelser blev identificeret eller formodet ved hjælp af HPLC-MS, herunder 23 flavoner og deres glucuronider, 6 phenethylalkoholglycosider, 20 triterpensaponiner, 15 lignaner og 18 andre forbindelser . Fan karakteriserede 40 absorberede bioaktive komponenter efter oral indgivelse af TMYX i rotteserum ved hjælp af UPLC/Q-TOF-MS . De 40 komponenter omfatter 2 fra Radix rehmanniae, 10 fra Radix codonopsis, 2 fra Radix ophiopogonis, 2 fra Ramulus cinnamomi, 19 fra Radix glycyrrhizae, 2 fra Radix polygoni multiflori preparata, 5 fra Caulis spatholobi, 1 fra Fructus jujubae og 1 fra Fructus schisandrae, hvoraf nogle er overlappede. De fleste af ingredienserne udøver antiinflammatoriske og antioxiderende virkninger og har desuden en kardiovaskulær beskyttende virkning. Holdet bestemmer også koncentrationerne af liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin, glycyrrhizinsyre og glycyrrhetinsyre i rotteplasma efter oral indgift af Radix glycyrrhizae eller kombinationen af Radix glycyrrhizae og Ramulus cinnamomi ved hjælp af HPLC-UV. Der findes imidlertid ingen publikation, der rapporterer om den farmakokinetiske undersøgelse af TMYX.

Farmakokinetik (PK) af TCM’er er en gren af TCM’ernes farmakologi. PK af TCM’er fokuserer på kvantitative undersøgelser af lovene for lægemiddelabsorption, -fordeling, -metabolisme og -udskillelse i en levende organisme. PK-undersøgelse af multikomponenter i TCM-recepter har været et af de vigtige forskningsaspekter i forbindelse med moderniseringen af TCM’er . PK-dataene kan belyse stoffets grundlag og afsløre TCM’s videnskabelige konnotation. Det spiller også en vigtig rolle i forbindelse med skabelsen af nye kinesiske lægemidler, forbedring af doseringsformer og formuleringsmekanismen. I den foreliggende undersøgelse blev der først udviklet en pålidelig og følsom HPLC-MS/MS-metode, som blev anvendt til den farmakokinetiske undersøgelse af 11 bioaktive komponenter, herunder rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre og isoliquiritigenin hos rotter efter oral indgift af TMYX. De farmakokinetiske egenskaber ved de vigtigste kemiske komponenter af TMYX i rotter blev afsløret, hvilket ville give et teoretisk grundlag for anvendelse af TMYX i klinisk.

2. Eksperimentelt

2.1. Kemikalier, reagenser og materialer

Methanol (kromatografisk renhed) og acetonitril (kromatografisk renhed) blev købt fra Merck Co., Ltd. Myresyre (kromatografisk renhed) blev fremstillet af ROE Co., Ltd. Ultrarent vand blev fremstillet med et Milli-Q vandrensningssystem (Millipore, Milford, MA, USA). Rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre, isoliquiritigenin og icariin blev købt fra Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). TMYX blev leveret af Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Kromatografiske og massespektrometriske betingelser

HPLC-MS/MS-systemet består af et Agilent 1200 højtydende væskekromatografi koblet med et Aglient 6430-serie triple quadrupolmassespektrometer med en elektrosprayioniseringskilde (ESI). Den kromatografiske adskillelse blev opnået på en CORTECS C18-kolonne (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), og kolonnetemperaturen blev holdt på 30 °C. Mobile faser bestående af 0,1 % myresyre i vand (A) og acetonitril (B) blev anvendt i den følgende gradienteluktionsmetode: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. Strømningshastigheden blev indstillet til 0,3 mL/min, og injektionsvolumenet var 10 μL. Alle data blev analyseret af Mass Hunter workstation software (Agilent Technologies, USA).

Massespektrometeret blev udført i både positiv og negativ ioniseringsmultireaktionsovervågning (MRM) mode. Kildeparametrene var som følger: kapillærspændingen indstillet til 300 V for positiv ioniseringstilstand og -300 V for negativ ioniseringstilstand, tørgasens temperatur var 320 °C, flowet var 11 L/min, og forstøvergasens tryk var 30 psi. Prækursor og produktion af ingredienserne og MRM-parametre blev vist i tabel 1.

2.3. Fremstilling af TMYX-ekstrakt

TMYX-ekstrakt blev fremstillet som følger: I alt 100 g TMYX-pulver blev vejet nøjagtigt og ekstraheret to gange under varmegenvinding med fire gange 60 % ethanol (v/v) i 1 time pr. gang. Herefter blev ekstraktionsopløsningerne filtreret og blandet. Den blandede opløsning blev koncentreret ved inddampning under reduceret tryk. Derefter blev de tørrede ekstrakter knust til pulver og opbevaret i en ekssikkator indtil analysen. Ekstrakterne indeholder henholdsvis rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre og isoliquiritigenin 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 og 9,6 μg/g. Strukturerne af forbindelserne i undersøgelsen blev vist i figur 1.

2.4. Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kvalitetskontrolprøver

For at fremstille stamopløsningen blev rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre, isoliquiritigenin og icariin (intern standardopløsning) vejet separat og fortyndet med methanol til en slutkoncentration på 1 mg/mL. Den blandede standardopløsning blev fremstillet ved at blande passende mængder af elleve stamopløsninger og fortynde dem med methanol.

Kalibreringsopløsningerne blev fremstillet ved at tilsætte 20 μL af den blandede standardopløsning og 20 μL af IS til 100 μL blankt rotteplasma. De endelige koncentrationer af serieanalyterne lå i intervallet 8-2000 ng/mL for glycyrrhizinsyre; 4-1000 ng/mL for liquiritin; 0,8-200 ng/mL for emodin, gallinsyre, ononin, schisandrin og stilbenglycosid; og 0,4-100 ng/mL for isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein og verbascosid.

Kvalitetskontrolprøver (QC) i tre koncentrationer (lav, middel og høj koncentration) blev sammensat af passende blandede standardopløsninger med blanke blodprøver som kalibreringsopløsninger for at opfylde de krævede koncentrationer. Alle opløsninger blev opbevaret ved 4°C.

2.5. Plasmaprøveforberedelse

Plasmaet (100 μL) blev tilsat 20 μL methanol, 20 μL af IS (icariin, 1 μg/mL) og 20 μL myresyre og derefter vortex-blandet. Blandingen blev ekstraheret med 800 μL ethylacetat ved vortexblanding i 5 min. ved stuetemperatur. Efter centrifugering ved 14 000 rpm i 10 min. blev supernatanten opsamlet i et rent rør og inddampet til tørhed under en nitrogenstrøm. Restproduktet blev rekonstitueret i 50 μL 50 % methanol, hvorefter det blev vortexet i 5 minutter og centrifugeret ved 14 000 rpm i 10 minutter. Endelig blev 10 μL supernatant injiceret i LC-MS/MS-systemet med henblik på analyse.

2.6. Metodevalidering

2.6.1. Specificitet

Specificiteten blev vurderet ved at analysere blanke blodprøver fra seks forskellige rotter. Hver plasmaprøve blev vurderet for endogen interferens ved hjælp af det foreslåede ekstraktionsprogram og LC-MS/MS-betingelserne ovenfor.

2.6.2. Linearitet og LLOQ

Lineariteten blev opnået ved at analysere blankt rotteplasma med en alvorlig af den blandede standardopløsning og IS i duplikat over 3 på hinanden følgende dage. Kalibreringskurverne blev plottet ved hjælp af peak-areal-forholdet (y) mellem analysanden og den interne standard over for den nominelle koncentration (x). Vægtfaktoren er 1/x. Den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) blev vurderet i henhold til basislinjestøjen, idet der blev defineret et signal/støj-forhold på ca. 10.

2.6.3. Præcision og nøjagtighed

Præcisionen og nøjagtigheden blev vurderet ved at bestemme QC-prøver ved lave, middelhøje og høje koncentrationsniveauer (20, 200 og 2000 ng/mL for glycyrrhizinsyre; 10, 100 og 1000 ng/mL for liquiritin; 2, 20 og 200 ng/mL for emodin, gallinsyre, ononin, schisandrin og stilbenglycosid; 1, 10 og 100 ng/mL for isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein og verbascosid). Alle koncentrationsniveauer blev målt i seks gentagelser. Præcisionen og nøjagtigheden blev testet en gang om dagen og gentaget i tre på hinanden følgende dage med standardkalibreringskurven. Præcisionen inden for og mellem dagene blev defineret som den relative standardafvigelse (RSD), mens nøjagtigheden blev bestemt ved den relative fejl (RE %).

2.6.4. Ekstraktionsgenvinding og matrixeffekt

Ekstraktionsgenvinding af elleve analyter på tre koncentrationsniveauer og IS blev analyseret ved at sammenligne de topområder, der blev opnået fra ekstraherede prøver, med dem af de efterekstraherede prøver. Prøvernes matrixeffekt og IS blev vurderet ved at vurdere forholdet mellem toppearealerne af analysanderne i de efterekstraherede spikede prøver og dem, der blev opnået fra de uekstraherede prøver. Både ekstraktionsgenvinding og matrixeffekt blev testet i seks parallelle forsøg.

2.6.5. Stabilitet

Stabiliteten af analytter i plasmaprøver blev bestemt ved at analysere QC-prøver af tre koncentrationsniveauer under forskellige betingelser: opbevaret i autosampler i 12 timer, ved stuetemperatur i 6 timer, under tre fryse-tø-cyklusser og opbevaret ved -70 °C i 14 dage. Alle stabilitetsundersøgelser blev målt i seks gentagelser.

2.7. Farmakokinetisk undersøgelse

Sprague-Dawley-rotter af hankøn (230-250 g) blev anskaffet fra Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd. Rotterne blev holdt under kontrolmiljøforhold, og de fastede i 12 timer med fri adgang til vand før eksperimenterne. TMYX-ekstrakterne blev opløst i CMC-Na og administreret oralt til rotterne med 8,3 g/kg. Blodprøverne (200 μL) blev opsamlet fra rottefossa orbitalis-venen 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 og 48 timer efter oral indgift i heparinerede rør. Og derefter blev blodprøverne centrifugeret ved 7.000 rpm i 10 min. for at få plasmaprøven straks. Endelig blev det opnåede plasma opbevaret ved -70 °C indtil analysen. Farmakokinetiske parametre blev beregnet ved hjælp af computerprogrammet “Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, Kina).

3. Resultat og diskussion

3.1. HPLC-MS/MS-metode

Der blev afprøvet flere mobile faser. Sammenlignet med et gradientmobilfasesystem med acetonitril-vand eller methanol-vand kunne mobilfasen, der indeholder 0,1 % myresyre i vand, forbedre topformen og øge analytternes signalrespons. Vi valgte derfor vand med 0,1 % myresyre som mobil fase.

Standardopløsningerne af henholdsvis analytter og intern standard blev injiceret i massespektrometeret. Ononin og schisandrin blev testet i positiv iontilstand, mens de andre blev testet i negativ tilstand. De optimerede precursor-til-produktionsovergange blev overvåget ved 238,9→211,0 for rhein, 269,0→225,0 for emodin, 405,2→242,8 for stilbenglycosid, 417,1→255,0 for liquiritin, 431,2→269,1 for ononin, 623.0→161,1 for verbascosid, 169,0→125,1 for gallinsyre, 433,3→384,2 for schisandrin, 255,3→119,1 for liquiritigenin, 821,1→350,5 for glycyrrhizinsyre, 255,1→118,9 for isoliquiritigenin og 721,0→513,2 for IS. Alle data blev vist i tabel 1.

3.2. Prøveforberedelse

I forsøget testede vi to metoder til at bortskaffe plasmaprøven, herunder væske-væskeekstraktion (LLE) og proteinudfældning (PPT). Resultaterne viser, at både metodernes genvinding og matrixeffekter opfylder kravene til bestemmelse af biologiske prøver, og at de endogene stoffer ikke forstyrrer analysen. PPT-metoden viste dog relativt set en lavere ekstraktionseffektivitet og en højere matrixeffekt. Derfor valgte vi væske-væskeekstraktion (LLE) med ethylacetat til at forberede prøven.

3.3. Metodevalidering

3.3.3.1. Specificitet

Specificiteten blev vurderet ved at sammenligne kromatogrammer af blanke blodprøver fra seks forskellige rotter med blodprøver, der indeholdt analytter. De repræsentative kromatogrammer af blindblodprøve, blindblodprøve indeholdende elleve analytter og IS og plasmaprøve fra en rotte efter oral indgivelse af TMYX-ekstrakter blev tilgået. Retentionstiden for rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre, isoliquiritigenin og IS var henholdsvis 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 og 12,19 minutter. På grundlag af kromatogrammerne forstyrrer endogene stoffer i plasmaprøverne ikke bestemmelsen af analytter og IS. Kromatogrammerne er vist i figur 2.

(a)

(b)

(c)

(a)
(a)
(b)
(c)

Figur 2

MRMK-kromatogrammer af elleve analytter. rhein (1), emodin (2), stilbenglycosid (3), glycyrrhizinsyre (4), liquiritin (5), liquiritigenin (6), isoliquiritigenin (7), ononin (8), verbascosid (9), gallinsyre (10), schisandrin (11) og IS (12). (a) blindplasma; (b) blindplasma tilsat analytterne og IS; (c) plasmaprøve efter oral indgift af TMYX-ekstrakt.

3.3.2. Linearitet og følsomhed

Resultaterne af kalibreringskurver, lineære intervaller, korrelationskoefficienter og LLOQ’er blev vist i tabel 2. Plasmakalibreringskurverne blev konstrueret inden for intervallet 8-2000 ng/mL for glycyrrhizinsyre; 4-1000 ng/mL for liquiritin; 0,8-200 ng/mL for emodin, gallinsyre, ononin, schisandrin og stilbenglycosid; 0,4-100 ng/mL for isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein og verbascosid.

LLOQ’erne for 11 analyter i plasmaprøven var mindre end 8 ng/mL, hvilket er følsomt nok til de farmakokinetiske undersøgelser.

3.3.3.3. Præcision og nøjagtighed

I dette assay blev intra- og interdagspræcisionen og nøjagtigheden analyseret ved tre koncentrationsniveauer i seks gentagelser. Dataene blev vist i tabel 3. RSD for intra- og interdagspræcision var mellem 0,7 og 9,3 %. RE for nøjagtigheden lå inden for ± 14,0 %. Resultaterne tyder på, at metoden er nøjagtig og kan gentages til analyse af alle analytter i rotteplasma.

3.3.4. Ekstraktionsgenvinding og matrixeffekt

Alle data for ekstraktionsgenvinding og matrixeffekt blev opsummeret i tabel 4. Ekstraktionsgenvindingen af 11 ingredienser ved tre koncentrationsniveauer lå inden for et interval på 85,2-109,1 %. Matrixeffekterne af alle analyterne varierede fra 89,2 til 113,4 %. Disse data viser, at forsøgsproceduren er effektiv, og at matrixvirkningerne kan ignoreres.

3.3.5. Stabilitet

For at undersøge stabiliteten af analyterne blev QC-prøver af tre koncentrationsniveauer under de forskellige opbevaringsbetingelser testet, herunder opbevaret i autosampler i 12 timer efter forberedelse, ved stuetemperatur i 6 timer, ved tre fryse-optøningscyklusser og ved -70 °C i 14 dage. Som det fremgår af tabel 5, tyder resultaterne på, at analysanderne er stabile under de ovennævnte betingelser.

3,4. Farmakokinetisk undersøgelse

Den validerede LC-MS/MS-metode blev anvendt til den farmakokinetiske undersøgelse af de elleve analyter i blodprøver fra rotter efter oral indgivelse af TMYX i en enkelt dosis på 8,3 g/kg. De vigtigste farmakokinetiske parametre blev vist i tabel 6. Og de gennemsnitlige plasmakoncentrationstidsprofiler for de elleve aktive bestanddele blev vist i figur 3.

Tmax for rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre og schisandrin er 0.36 ± 0,31 h, 0,32 ± 0,14 h, 0,50 ± 0,31 h, 0,50 ± 0,46 h, 0,46 ± 0,10 h, 0,37 ± 0,18 h, 0,75 ± 0,67 h og 1,00 ± 0,92 h, henholdsvis. Tmax viser, at otte ingredienser absorberes hurtigt. Der er påvist dobbelte toppe i de gennemsnitlige plasmakoncentrationstidsprofiler for liquiritigenin, glycyrrhizinsyre og isoliquiritigenin. Det første peak for tre ingredienser optrådte ved 0,20 h, 2,13 h og 0,28 h og det andet peak ved henholdsvis 7,20 h, 17,67 h og 7,00 h. Det kan skyldes hepatoenteral cirkulation. Der blev rapporteret om et peak plasmakoncentrationstidsprofil af liquiritigenin, isoliquiritigenin og glycyrrhizinsyre i rotteplasma efter oral indgivelse af Radix glycyrrhizae eller kombinationen af Radix glycyrrhizae og Ramulus cinnamomi . Forskellene kan skyldes virkningerne af andre urter i TMYX, hvilket kræver yderligere forsøg. Ud over dobbelte toppe varierer halveringstiden for eliminering (t1 /2) af rhein, emodin, galsyre, glycyrrhizin, stilbenglycosid, verbascosid, formonononetin og schisandrin fra 1,53 timer til 4,21 timer, hvilket tyder på, at disse otte analyter i rotteblodprøver elimineres hurtigt efter oral indgift. En lignende farmakokinetisk tendens for schisandrin blev rapporteret efter oral indgift af Fructus schisandrae vandigt ekstrakt . Det blev også rapporteret, at der blev observeret en top for emodin og gallinsyre hos rotter, der fik doseret Radix polygoni multiflori . t1 /2 for liquiritigenin, glycyrrhizinsyre og isoliquiritigenin er 12,70 timer, 18,19 timer og 13 timer.46 timer, hvilket indikerer, at ingrediensen har en længere behandlingstid, især isoliquiritigenin og glycyrrhizinsyre, som stadig kan påvises in vivo efter 48 timer.

4. Konklusion

I vores forsøg udviklede vi en metode til HPLC-MS/MS til påvisning af rhein, emodin, stilbenglycosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallinsyre, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyre og isoliquiritigenin i rotteplasma. De farmakokinetiske parametre vil være nyttige for den videre udvikling og anvendelse af TMYX i klinisk brug af TMYX. De 11 aktive bestanddele af TMYX, som blev absorberet i plasma, ville give data til støtte for forbedring af kvalitetskontrollen.

Datatilgængelighed

De data, der er anvendt til støtte for resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Akkreditering

Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81673824 og 81503457) og Tianjin Municipal Education Commission Research Project (2017KJ139).