Utveckling av en HPLC-MS/MS-metod för att bestämma 11 bioaktiva föreningar i Tongmai Yangxin-piller och tillämpning på en farmakokinetisk studie på råttor

Abstract

En känslig och tillförlitlig HPLC-MS/MS-metod har utvecklats och validerats för samtidig bestämning av elva bioaktiva föreningar (rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyra och isoliquiritigenin) i plasma från råttor efter oral administrering av Tongmai Yangxin-piller. De insamlade plasmaproverna bereddes genom vätske-vätskeextraktion med etylacetat efter syrning. Elva föreningar separerades på en CORTECS™ C18-kolonn med mobila faser bestående av 0,1 % myrsyra i avjoniserat vatten och acetonitril. Flödeshastigheten var 0,3 mL/min. Detektionen utfördes på ett tandemmassasystem med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI) i både positiv och negativ jonisering med användning av MRM-läge (Multiple Reaction Monitoring). Kalibreringskurvorna var linjära i intervallet 8-2000 ng/ml för glycyrrhizinsyra, 4-1000 ng/ml för liquiritin, 0,8-200 ng/ml för emodin, gallussyra, ononin, schisandrin och stilbenglykosid, 0,4-100 ng/ml för isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein respektive verbascosid. Intra- och interdagsprecisionen för analyterna var mindre än 9,3 % och 8,5 %. Noggrannheten inom och mellan dagarna låg i intervallet -14,0 % till 10,3 % och -6,5 % till 9,6 %. Samtidigt varierade extraktionsåtervinningen av analyterna i plasmaprover från 85,2 % till 109,1 % och matrisverkan från 89,2 % till 113,4 %. Den utvecklade metoden tillämpades framgångsrikt på farmakokinetiken för elva bioaktiva föreningar i råttplasma efter oral administrering av Tongmai Yangxin Pill recept.

1. Introduktion

Traditionell kinesisk medicin (TCM) är en värdefull naturskatt. TCM har använts kliniskt i tusentals år och får allt större uppmärksamhet tack vare den framgångsrika behandlingen av olika sjukdomar med minimala biverkningar . TCM-recept, som är den vanligaste formen av klinisk medicinering, har flera komponenter och flera mål. De många komponenterna och de många målen är överlägsna och karakteristiska för TCM:s farmakologiska verkan.

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) är ett traditionellt kinesiskt patentläkemedel som finns dokumenterat i den kinesiska farmakopén. Receptet utvecklades från ett välkänt örtpar ”GuiZhi-GanCao” dokumenterat i ”Shang-Han-Lun” av Zhongjing Zhang under den östra Han-dynastin. Receptet består av elva örter, däribland Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis och Fructus jujubae . TMYX har använts för att behandla kranskärlssjukdom, arytmi, bröstsmärta och angina i flera decennier . Moderna farmakologiska studier visar att TMYX har en betydande effekt på hjärtsjukdomar. Fyra aktiva flavonoidföreningar (glyasperin A, glycycoumarin, licorisoflavan A och licoisoflavon A) från TMYX visade sig ha tillfredsställande biologisk aktivitet och främja proliferation och angiogenes av endotelceller från humana navelsträngar i zebrafiskar. . Samtidigt rapporterade Liu et al. att fem fraktioner av TMYX visade sig utöva en antipitelial-mesenkymal övergångsaktivitet . Taos resultat visade att sex aktiva ingredienser med höga R-värden (gomisin D, schisandrin, glycyrrhizasyra, stilbenglykosid, formononetin och ononin) utövar antiinflammatoriska effekter på ett dosberoende sätt .

De farmakologiska effekterna av TMYX bygger på den varierande kemiska sammansättningen. Chen rapporterade att 80 föreningar identifierades eller förmodades med hjälp av HPLC-MS, inklusive 23 flavoner och deras glukuronider, 6 fenetylalkoholglykosider, 20 triterpensaponiner, 15 lignaner och 18 andra föreningar . Fan karakteriserade 40 absorberade bioaktiva komponenter efter oral administrering av TMYX i råttserum genom UPLC/Q-TOF-MS . De 40 komponenterna omfattar 2 från Radix rehmanniae, 10 från Radix codonopsis, 2 från Radix ophiopogonis, 2 från Ramulus cinnamomi, 19 från Radix glycyrrhizae, 2 från Radix polygoni multiflori preparata, 5 från Caulis spatholobi, 1 från Fructus jujubae och 1 från Fructus schisandrae, varav vissa överlappar varandra. De flesta av ingredienserna har antiinflammatoriska och antioxidativa effekter och har dessutom en skyddande effekt på hjärt- och kärlsystemet. Teamet fastställer också koncentrationerna av liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin, glycyrrhizinsyra och glycyrrhetinsyra i plasma från råttor efter oral administrering av Radix glycyrrhizae eller kombinationen av Radix glycyrrhizae och Ramulus cinnamomi genom HPLC-UV. Det finns dock ingen publikation som rapporterar den farmakokinetiska studien av TMYX.

Farmakokinetik (PK) av TCM är en gren av TCM:s farmakologi. PK av TCM fokuserar på kvantitativa studier av lagarna för läkemedelsabsorption, distribution, metabolism och utsöndring i en levande organism. PK-studier av flera komponenter i TCM-recept har varit en av de viktiga forskningsaspekterna av moderniseringen av TCM. PK-data kan belysa substansbasen och avslöja TCM:s vetenskapliga innebörd. Den spelar också en viktig roll för skapandet av nya kinesiska läkemedel, förbättringen av doseringsformer och mekanismen för formuleringsmekanismen. I denna studie utvecklades först en tillförlitlig och känslig HPLC-MS/MS-metod som tillämpades på den farmakokinetiska studien av 11 bioaktiva komponenter inklusive rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizasyra och isoliquiritigenin hos råttor efter oral administrering av TMYX. De farmakokinetiska egenskaperna hos de viktigaste kemiska komponenterna i TMYX hos råttor avslöjades, vilket skulle ge en teoretisk grund för användning av TMYX i kliniska.

2. Experimentellt

2.1. Kemikalier, reagenser och material

Metanol (kromatografisk renhet) och acetonitril (kromatografisk renhet) köptes från Merck Co., Ltd. Myrsyra (kromatografisk renhet) erhölls från ROE Co., Ltd. Ultrarent vatten framställdes med ett Milli-Q vattenreningssystem (Millipore, Milford, MA, USA). Rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyra, isoliquiritigenin och icariin köptes från Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). TMYX tillhandahölls av Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Kromatografiska och masspektrometriska förhållanden

HPLC-MS/MS-systemet består av en Agilent 1200 högpresterande vätskekromatografi kopplad till en Aglient 6430-serie trippelkvadrupolmasspektrometer med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI). Den kromatografiska separationen utfördes på en CORTECS C18-kolonn (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm) och kolonntemperaturen hölls på 30 °C. Mobila faser som bestod av 0,1 % myrsyra i vatten (A) och acetonitril (B) användes i följande gradientelutionsmetod: 0-10 min, 10 %-85 % B; 10-13 min, 85 %-95 % B; 13-19 min, 95 %-95 % B. Flödeshastigheten var inställd på 0,3 mL/min och injektionsvolymen var 10 μL. Alla data analyserades med programvaran Mass Hunter workstation (Agilent Technologies, USA).

Masspektrometern utfördes i både positivt och negativt joniseringsläge för övervakning av flera reaktioner (MRM). Källparametrarna var följande: kapillärspänningen inställd på 300 V för positivt joniseringsläge och -300 V för negativt joniseringsläge, torkgasens temperatur var 320 °C, flödet var 11 L/min och nebuliseringsgasens tryck var 30 psi. Prekursor och produktion av ingredienserna och MRM-parametrarna visades i tabell 1.

2.3. Beredning av TMYX-extrakt

TMYX-extrakt bereds på följande sätt: Totalt 100 g TMYX-pulver vägdes noggrant och extraherades två gånger under värmeåterflöde med fyra gånger 60 % etanol (v/v) i 1 timme per gång. Därefter filtrerades och blandades extraktionslösningarna. Den blandade lösningen koncentrerades genom avdunstning under reducerat tryck. Därefter krossades de torkade extrakten till pulver och förvarades i en exsickator fram till analysen. Extrakten innehåller rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizasyra och isoliquiritigenin 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 respektive 9,6 μg/g. Strukturerna för föreningarna i studien visas i figur 1.

Figur 1

Kemiska strukturer för elva komponenter.

2.4. Beredning av kalibreringslösningar och kvalitetskontrollprover

För att göra stamlösningen vägdes rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyra, isoliquiritigenin och icariin (intern standardlösning) separat och späddes ut med metanol till en slutkoncentration på 1 mg/mL. Den blandade standardlösningen erhölls genom att blanda lämplig volym av elva stamlösningar och spädas med metanol.

Kalibreringslösningarna framställdes genom att 20 μl av den blandade standardlösningen och 20 μl av IS spikades i 100 μl tom råttplasma. De slutliga koncentrationerna av serieanalyterna låg i intervallet 8-2000 ng/mL för glycyrrhizinsyra, 4-1000 ng/mL för liquiritin, 0,8-200 ng/mL för emodin, gallussyra, ononin, schisandrin och stilbenglykosid och 0,4-100 ng/mL för isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein och verbascosid.

Kvalitetskontrollprover (QC) i tre koncentrationer (låg, medelhög och hög koncentration) bestod av lämpliga blandade standardlösningar med blankt blodprov som kalibreringslösningar för att uppfylla de nödvändiga koncentrationerna. Alla lösningar förvarades vid 4°C.

2.5. Förberedelse av plasmaprov

Plasman (100 μL) spikades med 20 μL metanol, 20 μL IS (icariin, 1 μg/mL) och 20 μL myrsyra och blandades sedan i vortex. Blandningen extraherades med 800 μL etylacetat genom vortexblandning i 5 minuter i rumstemperatur. Efter centrifugering vid 14 000 rpm i 10 minuter samlades supernatanten upp i ett rent rör och avdunstades till torrhet under en kväveström. Resterna rekonstituerades i 50 μL 50 % metanol, vortexades i 5 minuter och centrifugerades vid 14 000 rpm i 10 minuter. Slutligen injicerades 10 μL supernatant i LC-MS/MS-systemet för analys.

2.6. Metodvalidering

2.6.1. Specificitet

Specificiteten bedömdes genom att analysera blanka blodprover från sex olika råttor. Varje plasmaprov utvärderades för endogen interferens med hjälp av det föreslagna extraktionsprogrammet och LC-MS/MS-förhållandena ovan.

2.6.2. Linjäritet och LLOQ

Linjäriteten uppnåddes genom att analysera blank råttplasma med en allvarlig mängd av den blandade standardlösningen och IS i duplikat under tre på varandra följande dagar. Kalibreringskurvorna plottades genom förhållandet mellan toppyta (y) för analyt och intern standard i förhållande till den nominella koncentrationen (x). Viktfaktorn är 1/x. Den nedre kvantifieringsgränsen (LLOQ) utvärderades i enlighet med baslinjebruset och definierade ett signal-brusförhållande på cirka 10.

2.6.3. Precision och noggrannhet

Precisionen och noggrannheten bedömdes genom att bestämma QC-prover vid låga, medelhöga och höga koncentrationsnivåer (20, 200 och 2000 ng/mL för glycyrrhizinsyra; 10, 100 och 1000 ng/ml för liquiritin, 2, 20 och 200 ng/ml för emodin, gallussyra, ononin, schisandrin och stilbenglykosid, 1, 10 och 100 ng/ml för isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein och verbascosid). Alla koncentrationsnivåer mättes i sex upprepningar. Precisionen och noggrannheten testades en gång om dagen och upprepades under tre på varandra följande dagar med hjälp av standardkalibreringskurvan. Precisionen inom och mellan dagarna definierades som den relativa standardavvikelsen (RSD), medan noggrannheten bestämdes av det relativa felet (RE %).

2.6.4. Extraktionsåtervinning och matrisverkan

Extraktionsåtervinningen av elva analyter på tre koncentrationsnivåer och IS testades genom att jämföra toppytorna från extraherade prover med toppytorna i de efterextraherade proverna. Matriseffekten av proverna och IS uppskattades genom förhållandet mellan toppområden för analyterna i efterextraherade spikade prover och de som erhållits från oextraherade prover. Både extraktionsåtervinningen och matriseffekten testades i sex paralleller.

2.6.5. Stabilitet

Stabiliteten hos analyter i plasmaprover bestämdes genom att analysera QC-prover med tre koncentrationsnivåer under olika förhållanden: förvarade i autosampler i 12 timmar, i rumstemperatur i 6 timmar, under tre cykler med frysning och upptining och förvarade vid -70 °C i 14 dagar. Alla stabilitetsstudier mättes i sex upprepningar.

2.7. Farmakokinetisk studie

Sprague-Dawley-råttor (230-250 g) erhölls från Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd. Råttorna hölls under kontrollerade miljöförhållanden och de fastade i 12 timmar med fri tillgång till vatten före experimenten. TMYX-extrakt löstes upp i CMC-Na och administrerades oralt till råttorna med 8,3 g/kg. Blodproverna (200 μL) samlades in från råttans fossa orbitalis ven vid 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 och 48 timmar efter oral administrering i hepariniserade rör. Och sedan centrifugerades blodproverna vid 7 000 rpm i 10 minuter för att få plasmaprovet omedelbart. Slutligen förvarades den erhållna plasman vid -70 °C fram till analysen. Farmakokinetiska parametrar beräknades med datorprogrammet ”Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, Kina).

3. Resultat och diskussion

3.1. HPLC-MS/MS-metod

Vissa rörliga faser testades. Jämfört med ett gradientmobilfasystem med acetonitril-vatten eller metanol-vatten kunde mobilfasen som innehåller 0,1 % myrsyra i vatten förbättra toppformen och öka signalresponsen för analyterna. Därför valde vi vatten som innehåller 0,1 % myrsyra som rörlig fas.

Standardlösningarna av analyter respektive intern standard injicerades i masspektrometern. Ononin och schisandrin testades i positivt jonläge, medan övriga testades i negativt jonläge. De optimerade övergångarna från prekursor till produktion övervakades vid 238,9→211,0 för rhein, 269,0→225,0 för emodin, 405,2→242,8 för stilbenglykosid, 417,1→255,0 för liquiritin, 431,2→269,1 för ononin, 623.0→161,1 för verbascosid, 169,0→125,1 för gallussyra, 433,3→384,2 för schisandrin, 255,3→119,1 för liquiritigenin, 821,1→350,5 för glycyrrhizinsyra, 255,1→118,9 för isoliquiritigenin och 721,0→513,2 för IS. Alla data visas i tabell 1.

3.2. Provberedning

I experimentet testade vi två metoder för att disponera plasmaprovet, inklusive vätske-vätskesextraktion (LLE) och proteinutfällning (PPT). Resultaten visar att både metodernas återvinning och matriseffekter uppfyller kraven för bestämning av biologiska prover och att de endogena ämnena inte stör analysen. Metoden PPT visade dock relativt sett lägre extraktionseffektivitet och högre matrisverkan. Följaktligen valde vi vätske-vätskeextraktion (LLE) med etylacetat för att förbereda provet.

3.3. Validering av metoden

3.3.1. Specificitet

Specificiteten uppskattades genom att jämföra kromatogrammen av blanka blodprover från sex olika råttor med blodprover som innehöll analyter. De representativa kromatogrammen av blankt blodprov, blankt blodprov som innehåller elva analyter och IS och plasmaprov som erhållits från en råtta efter oral administrering av TMYX-extrakt har tagits fram. Retentionstiden för rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyra, isoliquiritigenin och IS var 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 respektive 12,19 minuter. Enligt kromatogrammen stör inte endogena ämnen i plasmaproverna bestämningen av analyter och IS. Kromatogrammen visas i figur 2.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figur 2

MRM-kromatogram för elva analyter. Rhein (1), emodin (2), stilbenglykosid (3), glycyrrhizasyra (4), liquiritin (5), liquiritigenin (6), isoliquiritigenin (7), ononin (8), verbascosid (9), gallussyra (10), schisandrin (11) och IS (12). (a) Blank plasma, (b) blank plasma spikad med analyterna och IS, (c) plasmaprov efter oral administrering av TMYX-extrakt.

3.3.2. Linjäritet och känslighet

Resultaten av kalibreringskurvor, linjära intervall, korrelationskoefficienter och LLOQs visas i tabell 2. Plasmakalibreringskurvorna konstruerades inom intervallet 8-2000 ng/ml för glycyrrhizinsyra, 4-1000 ng/ml för liquiritin, 0,8-200 ng/ml för emodin, gallsyra, ononin, schisandrin och stilbenglykosid, 0,4-100 ng/ml för isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein och verbascosid.

LOQ för 11 analyter i plasmaprovet var mindre än 8 ng/mL, vilket är tillräckligt känsligt för farmakokinetiska studier.

3.3.3.3. Precision och noggrannhet

I denna analys analyserades precisionen och noggrannheten inom och mellan dagarna på tre koncentrationsnivåer i sex replikat. Uppgifterna visades i tabell 3. RSD för intra- och interdagsprecisionen låg mellan 0,7 och 9,3 %. RE för noggrannhet låg inom ±14,0 %. Resultaten tyder på att metoden är noggrann och repeterbar för analys av alla analyter i plasma från råttor.

3.3.4. Extraktionsåtervinning och matriseffekt

Alla data om extraktionsåtervinning och matriseffekt sammanfattades i tabell 4. Extraktionsåtervinningen av 11 ingredienser på tre koncentrationsnivåer låg inom intervallet 85,2-109,1 %. Matriseffekterna för alla analyter varierade mellan 89,2 och 113,4 %. Uppgifterna visar att experimentet är effektivt och att matriseffekterna kan ignoreras.

3.3.5. Stabilitet

För att undersöka analyternas stabilitet testades QC-prover av tre koncentrationsnivåer under de olika lagringsförhållandena, inklusive förvaring i autosampler i 12 timmar efter beredning, i rumstemperatur i 6 timmar, i tre frys- och upptiningcykler och i -70 °C i 14 dagar. Som framgår av tabell 5 tyder resultaten på att analyterna är stabila under ovanstående förhållanden.

3,4. Farmakokinetisk studie

Den validerade LC-MS/MS-metoden tillämpades på den farmakokinetiska studien av de elva analyterna i blodprov från råttor efter oral administrering av TMYX i en engångsdos på 8,3 g/kg. De viktigaste farmakokinetiska parametrarna visas i tabell 6. Och de elva aktiva beståndsdelarnas genomsnittliga plasmakoncentrationstidsprofiler visades i figur 3.

Tmax för rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra och schisandrin är 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h respektive 1,00±0,92 h. Tmax visar att åtta ingredienser absorberas snabbt. Dubbla toppar upptäcks i de genomsnittliga plasmakoncentrationstidsprofilerna för liquiritigenin, glycyrrhizinsyra och isoliquiritigenin. Den första toppen för tre ingredienser uppträdde vid 0,20 h, 2,13 h och 0,28 h och den andra toppen vid 7,20 h, 17,67 h respektive 7,00 h. Det kan bero på hepatoenteral cirkulation. En topp i plasmakoncentrationstidsprofilen för liquiritigenin, isoliquiritigenin och glycyrrhizinsyra rapporterades i råttplasma efter oral administrering av Radix glycyrrhizae eller kombinationen av Radix glycyrrhizae och Ramulus cinnamomi . Skillnaderna kan bero på effekterna av andra örter i TMYX, vilket kräver ytterligare experiment. Förutom dubbla toppar varierar halveringstiden för eliminering (t1 /2) av rhein, emodin, gallussyra, glycyrrhizin, stilbenglykosid, verbascosid, formonononetin och schisandrin från 1,53 h till 4,21 h, vilket tyder på att dessa åtta analyter i råttblodprov elimineras snabbt efter oral administrering. En liknande farmakokinetisk trend för schisandrin rapporterades efter oral administrering av vattenextrakt av Fructus schisandrae . Det rapporterades också att en topp observerades för emodin och gallussyra hos råttor som fick doserat bearbetat Radix polygoni multiflori . T1 /2 för liquiritigenin, glycyrrhizinsyra och isoliquiritigenin är 12,70 timmar, 18,19 timmar och 13 timmar.46 timmar, vilket tyder på att ingrediensen har en längre behandlingstid, särskilt isoliquiritigenin och glycyrrhizinsyra, som fortfarande kan påvisas in vivo efter 48 timmar.

4. Slutsats

I vårt experiment utvecklade vi en metod för HPLC-MS/MS för att detektera rhein, emodin, stilbenglykosid, liquiritin, ononin, verbascosid, gallussyra, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinsyra och isoliquiritigenin i plasma från råttor. De farmakokinetiska parametrarna skulle vara till hjälp för vidareutveckling och klinisk användning av TMYX. De 11 aktiva ingredienserna i TMYX, som absorberades i plasma, skulle ge datastöd för förbättring av kvalitetskontrollen.

Datatillgänglighet

Data som används för att stödja resultaten i denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (81673824 och 81503457) och Tianjin Municipal Education Commission Research Project (2017KJ139).