Entwicklung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Bestimmung von 11 bioaktiven Verbindungen in der Tongmai Yangxin Pille und Anwendung auf eine pharmakokinetische Studie an Ratten

Abstract

Eine empfindliche und zuverlässige HPLC-MS/MS-Methode wurde entwickelt und validiert für die gleichzeitige Bestimmung von elf bioaktiven Verbindungen (rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin) in Rattenplasma nach oraler Verabreichung von Tongmai Yangxin Pill. Die gesammelten Plasmaproben wurden durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat nach Ansäuerung aufbereitet. Elf Verbindungen wurden auf einer CORTECS™ C18-Säule mit mobilen Phasen bestehend aus 0,1% Ameisensäure in deionisiertem Wasser und Acetonitril getrennt. Die Flussrate betrug 0,3 mL/min. Die Detektion erfolgte mit einem Tandem-Massensystem mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) in positiver und negativer Ionisierung unter Verwendung des MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring). Die Kalibrierkurven waren linear über den Bereich von 8-2000 ng/ml für Glycyrrhizinsäure; 4-1000 ng/ml für Liquiritin; 0,8-200 ng/ml für Emodin, Gallussäure, Ononin, Schisandrin und Stilbenglykosid; 0,4-100 ng/ml für Isoliquiritigenin, Liquiritigenin, Rhein und Verbascosid, jeweils. Die Intra- und Intertagspräzision der Analyten betrug weniger als 9,3% bzw. 8,5%. Die Intra- und Interday-Genauigkeit lag im Bereich von -14,0 % bis 10,3 % und -6,5 % bis 9,6 %. Die Extraktionswiederfindung der Analyten in Plasmaproben reichte von 85,2 % bis 109,1 % und der Matrixeffekt von 89,2 % bis 113,4 %. Die entwickelte Methode wurde erfolgreich auf die Pharmakokinetik von elf bioaktiven Verbindungen im Rattenplasma nach oraler Verabreichung von Tongmai Yangxin Pillenrezept angewendet.

1. Einleitung

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist ein kostbarer Schatz der Natur. Die TCM wird seit Tausenden von Jahren in der klinischen Praxis eingesetzt und gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, da sie verschiedene Krankheiten erfolgreich und mit minimalen Nebenwirkungen behandelt. Die TCM-Rezeptur, die am häufigsten in der klinischen Medizin verwendet wird, besteht aus mehreren Komponenten und mehreren Zielen. Die Multikomponenten und Multitargets sind die Überlegenheit und das Merkmal der pharmakologischen Wirkungen der TCM.

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) ist ein traditionelles chinesisches Patentmedikament, das im chinesischen Arzneibuch dokumentiert ist. Die Rezeptur wurde aus einem bekannten Kräuterpaar „GuiZhi-GanCao“ entwickelt, das in „Shang-Han-Lun“ von Zhongjing Zhang in der östlichen Han-Dynastie dokumentiert wurde. Das Rezept besteht aus elf Kräutern, darunter Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis, und Fructus jujubae . TMYX wird seit mehreren Jahrzehnten zur Behandlung von koronaren Herzerkrankungen, Herzrhythmusstörungen, Brustschmerzen und Angina pectoris eingesetzt. Moderne pharmakologische Studien zeigen, dass TMYX eine signifikante Wirkung auf Herzkrankheiten hat. Es wurde festgestellt, dass vier aktive Flavonoidverbindungen (Glyasperin A, Glycycocumarin, Licorisoflavan A und Licoisoflavon A) aus TMYX eine zufriedenstellende biologische Aktivität aufweisen und die Proliferation und Angiogenese menschlicher Nabelvenenendothelzellen in Zebrafischen fördern. Unterdessen berichteten Liu et al., dass fünf Fraktionen von TMYX eine antiepithelial-mesenchymale Übergangsaktivität ausüben. Die Ergebnisse von Tao deuten darauf hin, dass sechs Wirkstoffe mit hohen R-Werten (Gomisin D, Schisandrin, Glycyrrhizinsäure, Stilbenglykosid, Formononetin und Ononin) dosisabhängig entzündungshemmende Wirkungen entfalten.

Die pharmakologischen Wirkungen von TMYX beruhen auf der vielfältigen chemischen Zusammensetzung. Chen berichtete, dass 80 Verbindungen mittels HPLC-MS identifiziert oder vermutet wurden, darunter 23 Flavone und ihre Glucuronide, 6 Phenethylalkoholglykoside, 20 Triterpensaponine, 15 Lignane und 18 andere Verbindungen. Fan charakterisierte 40 absorbierte bioaktive Komponenten nach oraler Verabreichung von TMYX im Rattenserum mittels UPLC/Q-TOF-MS. Zu den 40 Komponenten gehören 2 aus Radix rehmanniae, 10 aus Radix codonopsis, 2 aus Radix ophiopogonis, 2 aus Ramulus cinnamomi, 19 aus Radix glycyrrhizae, 2 aus Radix polygoni multiflori preparata, 5 aus Caulis spatholobi, 1 aus Fructus jujubae und 1 aus Fructus schisandrae, von denen sich einige überschneiden. Die meisten der Inhaltsstoffe wirken entzündungshemmend und antioxidativ und haben darüber hinaus eine schützende Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System. Das Team bestimmt auch die Konzentrationen von Liquiritin, Liquiritigenin, Isoliquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Glycyrrhetinsäure im Rattenplasma nach oraler Verabreichung von Radix glycyrrhizae oder der Kombination von Radix glycyrrhizae und Ramulus cinnamomi durch HPLC-UV. Es gibt jedoch keine Veröffentlichung, die über die pharmakokinetische Studie von TMYX berichtet.

Die Pharmakokinetik (PK) von TCMs ist ein Teilbereich der Pharmakologie von TCMs. Die PK von TCMs konzentriert sich auf die quantitative Untersuchung der Gesetze der Absorption, der Verteilung, des Stoffwechsels und der Ausscheidung von Arzneimitteln in einem lebenden Organismus. Die PK-Studie der Multikomponenten von TCM-Rezepten ist einer der wichtigsten Forschungsaspekte der Modernisierung der TCM. Die PK-Daten können die Substanzgrundlage erhellen und die wissenschaftliche Bedeutung der TCM aufzeigen. Sie spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer chinesischer Arzneimittel, bei der Verbesserung von Darreichungsformen und beim Mechanismus der Formulierung. In der vorliegenden Studie wurde zunächst eine zuverlässige und empfindliche HPLC-MS/MS-Methode entwickelt und auf die pharmakokinetische Untersuchung von 11 bioaktiven Komponenten, darunter Rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin, bei Ratten nach oraler Verabreichung von TMYX angewendet. Die pharmakokinetischen Eigenschaften der wichtigsten chemischen Komponenten von TMYX bei Ratten wurden aufgedeckt, was eine theoretische Grundlage für die Verwendung von TMYX in der Klinik bieten würde.

2. Experimentell

2.1. Chemikalien, Reagenzien und Materialien

Methanol (chromatographische Reinheit) und Acetonitril (chromatographische Reinheit) wurden von Merck Co., Ltd. erworben. Ameisensäure (chromatografische Reinheit) wurde von ROE Co., Ltd. bezogen. Ultrareines Wasser wurde mit einem Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Millipore, Milford, MA, USA) hergestellt. Rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure, Isoliquiritigenin und Icariin wurden von Chengdu Must Bio-Technology Co, Ltd. (Chengdu, China). TMYX wurde von Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co, Ltd. geliefert.

2.2. Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen

Das HPLC-MS/MS-System besteht aus einem Agilent 1200 Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographen, der mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer der Serie Aglient 6430 mit einer Elektrospray-Ionisierungsquelle (ESI) gekoppelt ist. Die chromatographische Trennung erfolgte auf einer CORTECS-C18-Säule (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), und die Säulentemperatur wurde auf 30 °C gehalten. Mobile Phasen, die aus 0,1% Ameisensäure in Wasser (A) und Acetonitril (B) bestanden, wurden in der folgenden Gradientenelutionsmethode verwendet: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. Die Durchflussrate wurde auf 0,3 mL/min eingestellt, und das Injektionsvolumen betrug 10 μL. Alle Daten wurden mit der Mass Hunter Workstation Software (Agilent Technologies, USA) analysiert.

Das Massenspektrometer wurde sowohl im Positiv- als auch im Negativ-Ionisations-Multiple-Reaction-Monitoring (MRM) Modus betrieben. Die Parameter der Quelle waren wie folgt: die Kapillarspannung war auf 300 V für den positiven Ionisierungsmodus und -300 V für den negativen Ionisierungsmodus eingestellt, die Temperatur des Trocknungsgases betrug 320°C, der Durchfluss betrug 11 L/min und der Druck des Zerstäubungsgases betrug 30 psi. Die Vorläufer und die Herstellung der Bestandteile sowie die MRM-Parameter sind in Tabelle 1 aufgeführt.

2.3. TMYX-Extrakt Zubereitung

TMYX-Extrakt wurde wie folgt hergestellt: Insgesamt 100 g TMYX-Pulver wurden genau eingewogen und zweimal mit viermal 60 % Ethanol (v/v) für jeweils 1 h unter Rückflusshitze extrahiert. Danach wurden die Extraktionslösungen filtriert und gemischt. Die gemischte Lösung wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Anschließend wurden die getrockneten Extrakte zu Pulver zerkleinert und bis zur Analyse in einem Exsikkator aufbewahrt. Die Extrakte enthalten Rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 bzw. 9,6 μg/g. Die Strukturen der Verbindungen in der Studie sind in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1

Chemische Strukturen von elf Komponenten.

2.4. Herstellung von Kalibrierlösungen und Qualitätskontrollproben

Zur Herstellung der Stammlösung wurden Rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure, Isoliquiritigenin und Ikariin (interne Standardlösung) getrennt gewogen und mit Methanol auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt. Die gemischte Standardlösung wurde durch Mischen des entsprechenden Volumens von elf Stammlösungen und Verdünnen mit Methanol erhalten.

Die Kalibrierungslösungen wurden durch Aufstocken von 20 μl der gemischten Standardlösung und 20 μl der internen Standardlösung in 100 μl leeres Rattenplasma hergestellt. Die Endkonzentrationen der Serienanalyten lagen im Bereich von 8-2000 ng/ml für Glycyrrhizinsäure; 4-1000 ng/ml für Liquiritin; 0,8-200 ng/ml für Emodin, Gallussäure, Ononin, Schisandrin und Stilbenglycosid; und 0,4-100 ng/ml für Isoliquiritigenin, Liquiritigenin, Rhein und Verbascosid.

Qualitätskontrollproben in drei Konzentrationen (niedrige, mittlere und hohe Konzentration) wurden aus entsprechenden gemischten Standardlösungen mit einer leeren Blutprobe als Kalibrierlösungen hergestellt, um die erforderlichen Konzentrationen zu erreichen. Alle Lösungen wurden bei 4°C aufbewahrt.

2.5. Plasmaprobenvorbereitung

Das Plasma (100 μL) wurde mit 20 μL Methanol, 20 μL des IS (Ikariin, 1 μg/mL) und 20 μL Ameisensäure versetzt und dann vortex-gemischt. Das Gemisch wurde mit 800 μl Ethylacetat durch Vortex-Mischen für 5 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 14 000 U/min wurde der Überstand in einem sauberen Röhrchen aufgefangen und unter Stickstoff zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 μl 50%igem Methanol rekonstituiert, 5 Minuten lang geschüttelt und 10 Minuten lang bei 14 000 U/min zentrifugiert. Schließlich wurden 10 μl Überstand zur Analyse in das LC-MS/MS-System injiziert.

2.6. Methodenvalidierung

2.6.1. Spezifität

Die Spezifität wurde durch die Analyse von Blindblutproben von sechs verschiedenen Ratten bewertet. Jede Plasmaprobe wurde unter Verwendung des oben vorgeschlagenen Extraktionsprogramms und der LC-MS/MS-Bedingungen auf endogene Interferenzen untersucht.

2.6.2. Linearität und LLOQ

Die Linearität wurde erreicht, indem Rattenplasma mit einem Serum der gemischten Standardlösung und IS an drei aufeinanderfolgenden Tagen in Doppelbestimmung untersucht wurde. Die Kalibrierkurven wurden durch die Peak-Flächen-Verhältnisse (y) des Analyten gegen den internen Standard gegen die nominale Konzentration (x) aufgetragen. Der Gewichtungsfaktor ist 1/x. Die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ) wurde anhand des Grundlinienrauschens bewertet, wobei ein Signal-Rausch-Verhältnis von etwa 10 definiert wurde.

2.6.3. Präzision und Genauigkeit

Die Präzision und Genauigkeit wurden durch die Bestimmung von QC-Proben bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen (20, 200 und 2000 ng/mL für Glycyrrhizinsäure; 10, 100 und 1000 ng/ml für Liquiritin; 2, 20 und 200 ng/ml für Emodin, Gallussäure, Ononin, Schisandrin und Stilbenglycosid; 1, 10 und 100 ng/ml für Isoliquiritigenin, Liquiritigenin, Rhein und Verbascosid). Alle Konzentrationswerte wurden in sechs Wiederholungen gemessen. Die Präzision und Richtigkeit wurden einmal pro Tag geprüft und an drei aufeinander folgenden Tagen mit der Standardkalibrierungskurve wiederholt. Die Intra- und Intertagspräzision wurde als relative Standardabweichung (RSD) definiert, während die Genauigkeit durch den relativen Fehler (RE %) bestimmt wurde.

2.6.4. Extraktionswiederfindung und Matrixeffekt

Die Extraktionswiederfindung von elf Analyten in drei Konzentrationsstufen und der IS wurden durch Vergleich der Peakflächen der extrahierten Proben mit denen der nachextrahierten Proben ermittelt. Der Matrixeffekt der Proben und der IS wurden anhand des Verhältnisses der Peakflächen der Analyten in den nachextrahierten dotierten Proben zu denen der nicht extrahierten Proben geschätzt. Sowohl die Extraktionswiederfindung als auch der Matrixeffekt wurden in sechs Parallelversuchen getestet.

2.6.5. Stabilität

Die Stabilität der Analyten in Plasmaproben wurde durch die Analyse von QC-Proben dreier Konzentrationsstufen unter verschiedenen Bedingungen bestimmt: 12 Stunden Lagerung im Autosampler, 6 Stunden bei Raumtemperatur, drei Gefrier-Auftau-Zyklen und 14 Tage Lagerung bei -70°C. Alle Stabilitätsstudien wurden in sechs Wiederholungen gemessen.

2.7. Pharmakokinetische Studie

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (230-250 g) wurden von Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd. bezogen. Die Ratten wurden unter kontrollierten Umweltbedingungen gehalten und vor den Experimenten 12 Stunden lang gefastet, wobei sie freien Zugang zu Wasser hatten. TMYX-Extrakte wurden in CMC-Na aufgelöst und den Ratten oral in einer Dosis von 8,3 g/kg verabreicht. Die Blutproben (200 μl) wurden 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der oralen Verabreichung in heparinisierte Röhrchen aus der Fossa-Orbitalis-Vene der Ratte entnommen. Anschließend wurden die Blutproben 10 Minuten lang bei 7.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um sofort die Plasmaprobe zu erhalten. Schließlich wurde das gewonnene Plasma bis zur Analyse bei -70°C gelagert. Die pharmakokinetischen Parameter wurden mit dem Computerprogramm „Drug and Statistics 2.0“ (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, China) berechnet.

3. Ergebnis und Diskussion

3.1. HPLC-MS/MS-Methode

Es wurden verschiedene mobile Phasen getestet. Im Vergleich zu einem Gradienten-Mobilphasensystem mit Acetonitril-Wasser oder Methanol-Wasser konnte die mobile Phase mit 0,1% Ameisensäure in Wasser die Peakform verbessern und die Signalantwort der Analyten erhöhen. Daher wählten wir Wasser mit 0,1 % Ameisensäure als mobile Phase.

Die Standardlösungen der Analyten und der interne Standard wurden jeweils in das Massenspektrometer injiziert. Ononin und Schisandrin wurden im Positiv-Ionen-Modus getestet, die anderen im Negativ-Modus. Die optimierten Übergänge von der Vorstufe zur Produktion wurden bei 238.9→211.0 für Rhein, 269.0→225.0 für Emodin, 405.2→242.8 für Stilbenglycosid, 417.1→255.0 für Liquiritin, 431.2→269.1 für Ononin, 623.0→161.1 für Verbascosid, 169.0→125.1 für Gallussäure, 433.3→384.2 für Schisandrin, 255.3→119.1 für Liquiritigenin, 821.1→350.5 für Glycyrrhizinsäure, 255.1→118.9 für Isoliquiritigenin, und 721.0→513.2 für IS. Alle Daten wurden in Tabelle 1 aufgeführt.

3.2. Probenvorbereitung

In dem Experiment haben wir zwei Methoden zur Entsorgung der Plasmaprobe getestet, darunter die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) und die Proteinfällung (PPT). Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Wiederfindung als auch die Matrixeffekte der Methoden die Anforderungen für die Bestimmung biologischer Proben erfüllen und die endogenen Substanzen die Analyse nicht beeinträchtigen. Die PPT-Methode zeigte jedoch eine geringere Extraktionseffizienz und einen relativ höheren Matrixeffekt. Folglich wählten wir die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) mit Ethylacetat zur Vorbereitung der Probe.

3.3. Methodenvalidierung

3.3.1. Spezifität

Die Spezifität wurde durch Vergleich der Chromatogramme von Blindproben von sechs verschiedenen Ratten mit Blutproben, die Analyten enthalten, geschätzt. Es wurde auf die repräsentativen Chromatogramme einer leeren Blutprobe, einer leeren Blutprobe, die elf Analyten und IS enthielt, und einer Plasmaprobe zugegriffen, die von einer Ratte nach oraler Verabreichung von TMYX-Extrakten gewonnen wurde. Die Retentionszeit von Rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure, Isoliquiritigenin und IS betrug 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 bzw. 12,19 Minuten. Aus den Chromatogrammen geht hervor, dass die endogenen Substanzen in den Plasmaproben die Bestimmung der Analyten und des IS nicht beeinträchtigen. Die Chromatogramme sind in Abbildung 2 dargestellt.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 2

MRM-Chromatogramme von elf Analyten. Rhein (1), Emodin (2), Stilbenglykosid (3), Glycyrrhizinsäure (4), Liquiritin (5), Liquiritigenin (6), Isoliquiritigenin (7), Ononin (8), Verbascosid (9), Gallussäure (10), Schisandrin (11), und IS (12). (a) Leerplasma; (b) mit den Analyten und IS dotiertes Leerplasma; (c) Plasmaprobe nach oraler Verabreichung von TMYX-Extrakt.

3.3.2. Linearität und Empfindlichkeit

Die Ergebnisse der Kalibrierkurven, linearen Bereiche, Korrelationskoeffizienten und LLOQs sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Plasmakalibrierkurven wurden im Bereich von 8-2000 ng/ml für Glycyrrhizinsäure; 4-1000 ng/ml für Liquiritin; 0,8-200 ng/ml für Emodin, Gallussäure, Ononin, Schisandrin und Stilbenglykosid; 0,4-100 ng/ml für Isoliquiritigenin, Liquiritigenin, Rhein und Verbascosid erstellt.

Die LLOQs für 11 Analyten in der Plasmaprobe waren kleiner als 8 ng/mL, was für die pharmakokinetischen Studien empfindlich genug ist.

3.3.3. Präzision und Genauigkeit

In diesem Test wurden die Intra- und Interday-Präzision und -Genauigkeit bei drei Konzentrationsstufen in sechs Wiederholungen analysiert. Die Daten sind in Tabelle 3 dargestellt. Die RSD der Intra- und Interday-Präzision lag zwischen 0,7 und 9,3 %. Der RE der Genauigkeit lag innerhalb von ±14,0 %. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Methode genau und wiederholbar für die Analyse aller Analyten in Rattenplasma ist.

3.3.4. Extraktionswiederfindung und Matrixeffekt

Alle Daten zur Extraktionswiederfindung und zum Matrixeffekt wurden in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Extraktionswiederfindung von 11 Inhaltsstoffen in drei Konzentrationsstufen lag im Bereich von 85,2-109,1%. Die Matrixeffekte aller Analyten reichten von 89,2 bis 113,4%. Die Daten zeigen, dass die Vorgehensweise des Experiments effizient ist und die Matrixeffekte vernachlässigt werden konnten.

3.3.5. Stabilität

Um die Stabilität der Analyten zu untersuchen, wurden QC-Proben in drei Konzentrationsstufen unter verschiedenen Lagerungsbedingungen getestet, einschließlich der Lagerung im Autosampler für 12 Stunden nach der Vorbereitung, bei Raumtemperatur für 6 Stunden, bei drei Gefrier-Auftau-Zyklen und bei -70°C für 14 Tage. Wie in Tabelle 5 dargestellt, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Analyten unter den oben genannten Bedingungen stabil sind.

3.4. Pharmakokinetische Studie

Die validierte LC-MS/MS-Methode wurde für die pharmakokinetische Studie der elf Analyten in Rattenblutproben nach oraler Verabreichung von TMYX in einer Einzeldosis von 8,3 g/kg angewendet. Die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter sind in Tabelle 6 dargestellt. Und die mittleren Plasmakonzentrations-Zeit-Profile der elf Wirkstoffe sind in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3

Mittlere Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven von Rhein, Emodin, Stilbenglycosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin nach oraler Verabreichung von TMYX-Extrakt (Mittelwert ± SD, n=6).

Die Tmax von Rhein, Emodin, Stilbenglycosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure und Schisandrin sind 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h bzw. 1,00±0,92 h. Die Tmax zeigt, dass acht Inhaltsstoffe schnell resorbiert werden. In den mittleren Plasmakonzentrations-Zeit-Profilen von Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin wurden Doppelspitzen festgestellt. Der erste Peak von drei Inhaltsstoffen erschien um 0,20 h, 2,13 h und 0,28 h und der zweite Peak um 7,20 h, 17,67 h bzw. 7,00 h. Dies könnte auf den hepatoenteralen Kreislauf zurückzuführen sein. Nach oraler Verabreichung von Radix glycyrrhizae oder der Kombination von Radix glycyrrhizae und Ramulus cinnamomi wurden im Rattenplasma unterschiedliche Spitzenwerte der Plasmakonzentration von Liquiritigenin, Isoliquiritigenin und Glycyrrhizinsäure festgestellt. Die Unterschiede könnten auf die Wirkungen anderer Kräuter in TMYX zurückzuführen sein, was weitere Experimente erfordert. Neben den Doppelspitzen liegt die Eliminationshalbwertszeit (t1 /2) von Rhein, Emodin, Gallussäure, Glycyrrhizin, Stilbenglykosid, Verbascosid, Formononetin und Schisandrin zwischen 1,53 und 4,21 Stunden, was darauf hindeutet, dass diese acht Analyten in Rattenblutproben nach oraler Verabreichung schnell eliminiert werden. Ein ähnlicher pharmakokinetischer Trend wurde für Schisandrin nach oraler Verabreichung des wässrigen Extrakts von Fructus schisandrae festgestellt. Es wurde auch berichtet, dass ein Peak für Emodin und Gallussäure bei Ratten nach Verabreichung von Radix polygoni multiflori beobachtet wurde. Die t1 /2 von Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin betragen 12,70 h, 18,19 h und 13.46 h, was darauf hinweist, dass der Inhaltsstoff eine längere Behandlungszeit hat, insbesondere Isoliquiritigenin und Glycyrrhizinsäure, die in vivo noch nach 48 h nachgewiesen werden können.

4. Schlussfolgerung

In unserem Experiment haben wir eine HPLC-MS/MS-Methode zum Nachweis von Rhein, Emodin, Stilbenglykosid, Liquiritin, Ononin, Verbascosid, Gallussäure, Schisandrin, Liquiritigenin, Glycyrrhizinsäure und Isoliquiritigenin im Rattenplasma entwickelt. Die pharmakokinetischen Parameter wären hilfreich für die weitere Entwicklung und den Einsatz von TMYX in der Klinik. Die 11 Wirkstoffe von TMYX, die in das Plasma absorbiert wurden, würden Daten zur Verbesserung der Qualitätskontrolle liefern.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Dankbarkeit

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (81673824 und 81503457) und dem Tianjin Municipal Education Commission Research Project (2017KJ139) unterstützt.