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Abstract

Se ha desarrollado y validado un método HPLC-MS/MS sensible y fiable para la determinación simultánea de once compuestos bioactivos (rhein, emodina, glucósido de estilbeno, liquiritina, ononina, verbascósido, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrícico y isoliquiritigenina) en plasma de rata tras la administración oral de la píldora Tongmai Yangxin. Las muestras de plasma recogidas se prepararon mediante extracción líquido-líquido con acetato de etilo tras acidificación. Se separaron once compuestos en una columna CORTECS™ C18 con fases móviles consistentes en ácido fórmico al 0,1% en agua desionizada y acetonitrilo. El caudal fue de 0,3 mL/min. La detección se realizó en un sistema de masas en tándem con una fuente de ionización por electrospray (ESI) en ionización positiva y negativa utilizando el modo de monitorización de reacción múltiple (MRM). Las curvas de calibración fueron lineales en el rango de 8-2000 ng/mL para el ácido glicirrícico; 4-1000 ng/mL para la liquiritina; 0,8-200 ng/mL para la emodina, el ácido gálico, la ononina, la esquisandrina y el glucósido de estilbeno; 0,4-100 ng/mL para la isoliquiritigenina, la liquiritigenina, la reína y el verbascósido, respectivamente. La precisión intra e interdiaria de los analitos fue inferior al 9,3% y al 8,5%. La precisión intra e interdiaria estuvo en el rango de -14,0% a 10,3% y -6,5% a 9,6%. Mientras tanto, la recuperación de la extracción de los analitos en muestras de plasma osciló entre el 85,2% y el 109,1% y el efecto de la matriz entre el 89,2% y el 113,4%. El método desarrollado se aplicó con éxito a la farmacocinética de once compuestos bioactivos en el plasma de ratas tras la administración oral de la receta de la píldora Tongmai Yangxin.

1. Introducción

La Medicina Tradicional China (MTC) es un precioso tesoro de la naturaleza. La MTC se ha utilizado en la clínica durante miles de años y atrae cada vez más atención debido al tratamiento de diversas enfermedades con éxito y con mínimos efectos secundarios . La prescripción de MTC, la forma más utilizada en la medicación clínica, tiene múltiples componentes y objetivos. Los multicomponentes y los multiobjetivos son la superioridad y la característica de las acciones farmacológicas de la MTC.

La píldora Yangxin de Tongmai (TMYX) es un medicamento tradicional chino patentado y documentado en la Farmacopea China. La receta se desarrolló a partir de un conocido par de hierbas «GuiZhi-GanCao» documentado en «Shang-Han-Lun» por Zhongjing Zhang en la dinastía Han oriental. La receta consta de once hierbas, entre ellas Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis y Fructus jujubae . El TMYX se ha utilizado durante varias décadas para tratar las enfermedades coronarias, las arritmias, el dolor de pecho y la angina de pecho. Los estudios farmacológicos modernos demuestran que el TMYX tiene un efecto significativo en las enfermedades del corazón. Se descubrió que cuatro compuestos flavonoides activos (glyasperin A, glycycoumarin, licorisoflavan A y licoisoflavone A) de la TMYX tienen una actividad biológica satisfactoria y promueven la proliferación y la angiogénesis de las células endoteliales de la vena umbilical humana en el pez cebra . Por su parte, Liu et al. informaron de que cinco fracciones de TMYX ejercían una actividad antitransición epitelial-mesenquimal . Los resultados de Tao indicaron que seis ingredientes activos con altos valores R (gomisina D, schisandrin, ácido glicirrícico, glucósido de estilbeno, formononetina y ononina) ejercen efectos antiinflamatorios de manera dependiente de la dosis.

Los efectos farmacológicos de la TMYX se basan en la diversa composición química. Chen informó que se identificaron o conjeturaron 80 compuestos mediante HPLC-MS, incluyendo 23 flavonas y sus glucurónidos, 6 glucósidos de alcohol fénico, 20 saponinas triterpénicas, 15 lignanos y otros 18 compuestos . Fan caracterizó 40 componentes bioactivos absorbidos tras la administración oral de TMYX en suero de rata mediante UPLC/Q-TOF-MS . Los 40 componentes incluyen 2 del Radix rehmanniae, 10 del Radix codonopsis, 2 del Radix ophiopogonis, 2 del Ramulus cinnamomi, 19 del Radix glycyrrhizae, 2 del Radix polygoni multiflori preparata, 5 del Caulis spatholobi, 1 del Fructus jujubae y 1 del Fructus schisandrae, algunos de los cuales se superponen. La mayoría de los ingredientes ejercen efectos antiinflamatorios y antioxidantes, ejerciendo además el efecto protector cardiovascular. El equipo también determina las concentraciones de liquiritina, liquiritigenina, isoliquiritigenina, ácido glicirrícico y ácido glicirretínico en el plasma de ratas tras la administración oral de Radix glycyrrhizae o de la combinación de Radix glycyrrhizae y Ramulus cinnamomi mediante HPLC-UV. Sin embargo, no hay ninguna publicación que informe sobre el estudio farmacocinético del TMYX.

La farmacocinética (PK) de las MTC es una rama de la farmacología de las MTC. La PK de las MTC se centra en el estudio cuantitativo de las leyes de absorción, distribución, metabolismo y excreción de los fármacos en un organismo vivo. El estudio de la PK de los multicomponentes de la prescripción de MTC ha sido uno de los aspectos de investigación importantes de la modernización de la MTC. Los datos de PK podrían dilucidar la base de la sustancia y revelar la connotación científica de las MTC. También desempeña un papel importante en la creación de nuevos medicamentos chinos, la mejora de las formas de dosificación y el mecanismo de formulación. En el presente estudio, se desarrolló por primera vez un método fiable y sensible de HPLC-MS/MS y se aplicó al estudio farmacocinético de 11 componentes bioactivos, entre ellos la reína, la emodina, el glucósido de estilbeno, la liquiritina, la ononina, el verbascósido, el ácido gálico, la esquisandrina, la liquiritigenina, el ácido glicirrícico y la isoliquiritigenina en ratas tras la administración oral de TMYX. Se revelaron las características farmacocinéticas de los principales componentes químicos del TMYX en ratas, lo que proporcionaría una base teórica para el uso del TMYX en la clínica.

2. Experimental

2.1. Productos químicos, reactivos y materiales

El metanol (pureza cromatográfica) y el acetonitrilo (pureza cromatográfica) se adquirieron en Merck Co. El ácido fórmico (pureza cromatográfica) se obtuvo de ROE Co. El agua ultrapura se preparó con un sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore, Milford, MA, USA). La reína, la emodina, el glucósido de estilbeno, la liquiritina, la ononina, el verbascósido, el ácido gálico, la esquisandrina, la liquiritigenina, el ácido glicirrícico, la isoliquiritigenina y la icariina se compraron a Chengdu Must Bio-Technology Co. (Chengdu, China). Los TMYX fueron suministrados por Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Condiciones cromatográficas y de espectrometría de masas

El sistema HPLC-MS/MS consta de un cromatógrafo líquido de alto rendimiento Agilent 1200 acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo de la serie Aglient 6430 con una fuente de ionización por electrospray (ESI). La separación cromatográfica se realizó en una columna CORTECS C18 (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C. Se utilizaron fases móviles que consistían en ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y acetonitrilo (B) en el siguiente método de elución en gradiente: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. El caudal se fijó en 0,3 mL/min, y el volumen de inyección fue de 10 μL. Todos los datos se analizaron con el software de la estación de trabajo Mass Hunter (Agilent Technologies, EE.UU.).

El espectrómetro de masas se llevó a cabo en modo de monitorización de reacción múltiple (MRM) de ionización positiva y negativa. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: el voltaje del capilar se fijó en 300 V para el modo de ionización positiva y en -300 V para el modo de ionización negativa, la temperatura del gas de secado fue de 320°C, el flujo fue de 11 L/min y la presión del gas de nebulización fue de 30 psi. El precursor y la producción de los ingredientes y los parámetros de MRM se mostraron en la Tabla 1.

Compuestos Ión precursor (m/z) Ión producto (m/z) Frag. (V) C.E. (V)
rhein 238.9 211.0 140 -10
emodin 269.0 225,0 145 -20
glicósido de estilbeno 405,2 242.8 145 -13
liquiritina 417.1 255.0 145 -13
ononina 431.2 269.1 10 13
verbascósido 623,0 161,1 116 -33
ácido gálico 169,0 125.1 123 -12
schisandrin 433.3 384.2 100 14
liquiritigenina 255.3 119.1 121 -24
ácido glicirrícico 821,1 350,5 125 -40
isoliquiritigenina 255.1 118,9 106 -23
icariina (IS) 721,0 513.2 145 -10
Tabla 1
Propiedades del espectro de masas de 11 analitos e IS.

2.3. Preparación del extracto de TMYX

El extracto de TMYX se preparó como sigue: Se pesó con precisión un total de 100 g de polvo de TMYX y se extrajo dos veces bajo reflujo de calor con cuatro cantidades de etanol al 60% (v/v) durante 1 h por vez. Después, las soluciones de extracción se filtraron y se mezclaron. La solución mezclada se concentró por evaporación a presión reducida. A continuación, los extractos secos se trituraron hasta convertirlos en polvo y se guardaron en un desecador hasta su análisis. Los extractos contienen reína, emodina, glucósido de estilbeno, liquiritina, ononina, verbascósido, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrícico e isoliquiritigenina 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 y 9,6 μg/g, respectivamente. Las estructuras de los compuestos del estudio se mostraron en la Figura 1.

Figura 1
Estructuras químicas de once componentes.
2.4. Preparación de las soluciones de calibración y de las muestras de control de calidad

Para hacer la solución madre, se pesaron por separado la reína, la emodina, el glucósido de estilbeno, la liquiritina, la ononina, el verbascósido, el ácido gálico, la esquisandrina, la liquiritigenina, el ácido glicirrícico, la isoliquiritigenina y la icariina (solución estándar interna) y se diluyeron con metanol hasta una concentración final de 1 mg/mL. La solución estándar mixta se obtuvo mezclando el volumen apropiado de once soluciones madre y diluyéndolas con metanol.

Las soluciones de calibración se prepararon añadiendo los 20 μL de la solución estándar mixta y 20 μL de IS en 100 μL de plasma de rata en blanco. Las concentraciones finales de los analitos de la serie estaban en el rango de 8-2000 ng/mL para el ácido glicirrícico; 4-1000 ng/mL para la liquiritina; 0,8-200 ng/mL para la emodina, el ácido gálico, la ononina, la esquisandrina y el glucósido de estilbeno; y 0,4-100 ng/mL para la isoliquiritigenina, la liquiritigenina, la reína y el verbascósido.

Las muestras de control de calidad (CC) en tres concentraciones (baja, media y alta concentración) se hicieron con soluciones estándar mixtas apropiadas con muestra de sangre en blanco como soluciones de calibración para cumplir con las concentraciones requeridas. Todas las soluciones se mantuvieron a 4°C.

2.5. Preparación de la muestra de plasma

El plasma (100 μL) se adicionó con 20 μL de metanol, 20 μL del IS (icariina, 1 μg/mL), y 20 μL de ácido fórmico y luego se mezcló en vórtex. La mezcla se extrajo con 800 μL de acetato de etilo mediante mezcla en vórtex durante 5 min a temperatura ambiente. Tras centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se recogió en un tubo limpio y se evaporó a sequedad bajo una corriente de nitrógeno. El residuo se reconstituyó en 50 μL de metanol al 50%, se agitó en vórtex durante 5 min y se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min. Finalmente, se inyectaron 10 μL de sobrenadante en el sistema LC-MS/MS para su análisis.

2.6. Validación del método
2.6.1. Especificidad

La especificidad se evaluó analizando muestras de sangre en blanco de seis ratas diferentes. Se evaluó la interferencia endógena de cada muestra de plasma utilizando el programa de extracción sugerido y las condiciones de LC-MS/MS mencionadas anteriormente.

2.6.2. Linealidad y LLOQ

La linealidad se logró ensayando plasma de rata en blanco con una seria de la solución estándar mezclada e IS por duplicado durante 3 días consecutivos. Las curvas de calibración se trazaron mediante las relaciones pico-área (y) del analito contra el estándar interno frente a la concentración nominal (x). El factor de peso es 1/x. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) se evaluó según el ruido de la línea base, definiendo una relación señal/ruido de aproximadamente 10.

2.6.3. Precisión y exactitud

La precisión y exactitud se evaluaron determinando muestras de control de calidad a niveles de concentración bajos, medios y altos (20, 200 y 2000 ng/mL para el ácido glicirrícico; 10, 100 y 1000 ng/mL para la liquiritina; 2, 20 y 200 ng/mL para la emodina, el ácido gálico, la ononina, la esquisandrina y el glucósido de estilbeno; 1, 10 y 100 ng/mL para la isoliquiritigenina, la liquiritigenina, la reína y el verbascósido). Todos los niveles de concentración se midieron en seis réplicas. La precisión y la exactitud se comprobaron una vez al día y se repitieron durante 3 días consecutivos con la curva de calibración estándar. La precisión intra e interdiaria se definió como la desviación estándar relativa (RSD), mientras que la exactitud se determinó por el error relativo (RE %).

2.6.4. La recuperación de la extracción y el efecto de la matriz

La recuperación de la extracción de once analitos en tres niveles de concentración y el IS se ensayaron comparando las áreas de los picos obtenidas de las muestras extraídas con las de las muestras postextraídas. El efecto de la matriz de las muestras y el IS se estimaron mediante las relaciones de las áreas de los picos de los analitos en las muestras enriquecidas postextraídas con respecto a las obtenidas de las muestras no extraídas. Tanto la recuperación de la extracción como el efecto de la matriz se probaron en seis paralelos.

2.6.5. Estabilidad

La estabilidad de los analitos en las muestras de plasma se determinó analizando muestras de control de calidad de tres niveles de concentración en diferentes condiciones: almacenadas en el automuestreador durante 12 h, a temperatura ambiente durante 6 h, bajo tres ciclos de congelación y descongelación y almacenadas a -70 °C durante 14 días. Todos los estudios de estabilidad se midieron en seis réplicas.

2.7. Estudio farmacocinético

Las ratas Sprague-Dawley macho (230-250 g) se obtuvieron de Beijing HFK Experimental Animal Technology Co. Ltd. Las ratas se mantuvieron en condiciones ambientales de control y ayunaron durante 12 h con libre acceso al agua antes de los experimentos. Los extractos de TMYX se disolvieron en CMC-Na y se administraron por vía oral a las ratas a razón de 8,3 g/kg. Las muestras de sangre (200 μL) se recogieron de la vena de la fosa orbital de la rata a las 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 y 48 h después de la administración oral en tubos heparinizados. A continuación, las muestras de sangre se centrifugaron a 7.000 rpm durante 10 minutos para obtener inmediatamente la muestra de plasma. Finalmente, el plasma obtenido se almacenó a -70°C hasta su análisis. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el programa informático «Drug and Statistics 2.0» (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, China).

3. Resultado y discusión

3.1. Método HPLC-MS/MS

Se probaron varias fases móviles. En comparación con un sistema de fase móvil de gradiente con acetonitrilo-agua o metanol-agua, la fase móvil que contiene 0,1% de ácido fórmico en agua podría mejorar la forma del pico y aumentar la respuesta de la señal de los analitos. Por lo tanto, elegimos el agua que contiene 0,1% de ácido fórmico como fase móvil.

Las soluciones estándar de los analitos y el estándar interno se inyectaron en el espectrómetro de masas, respectivamente. La ononina y la esquisandrina se analizaron en modo de iones positivos, mientras que los demás en negativo. Las transiciones optimizadas del precursor a la producción se monitorizaron en 238,9→211,0 para la reína, 269,0→225,0 para la emodina, 405,2→242,8 para el glucósido de estilbeno, 417,1→255,0 para la liquiritina, 431,2→269,1 para la ononina, 6230→161,1 para el verbascósido, 169,0→125,1 para el ácido gálico, 433,3→384,2 para la esquisandrina, 255,3→119,1 para la liquiritigenina, 821,1→350,5 para el ácido glicirrícico, 255,1→118,9 para la isoliquiritigenina y 721,0→513,2 para el IS. Todos los datos se mostraron en la Tabla 1.

3.2. Preparación de la muestra

En el experimento, probamos dos métodos para disponer la muestra de plasma incluyendo la extracción líquido-líquido (LLE) y la precipitación de proteínas (PPT). Los resultados muestran que tanto la recuperación como los efectos de matriz de los métodos cumplen los requisitos para la determinación de muestras biológicas y las sustancias endógenas no interfieren en el análisis. Sin embargo, el método de PPT mostró una menor eficiencia de extracción y un mayor efecto matriz relativamente. En consecuencia, seleccionamos la extracción líquido-líquido (LLE) con acetato de etilo para preparar la muestra.

3.3. Validación del método
3.3.1. Especificidad

La especificidad se estimó comparando cromatogramas de muestras de sangre en blanco de seis ratas diferentes con muestras de sangre que contenían analitos. Se accedió a los cromatogramas representativos de la muestra de sangre en blanco, de la muestra de sangre en blanco que contenía once analitos e IS, y de la muestra de plasma obtenida de una rata tras la administración oral de extractos de TMYX. El tiempo de retención de la reína, la emodina, el glucósido estilbeno, la liquiritina, la ononina, el verbascósido, el ácido gálico, la esquisandrina, la liquiritigenina, el ácido glicirrícico, la isoliquiritigenina y el IS fue de 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 y 12,19 minutos, respectivamente. Según los cromatogramas, las sustancias endógenas de las muestras de plasma no interfieren en la determinación de los analitos y del IS. Los cromatogramas se mostraron en la Figura 2.


(a)

(b)

(c)


(a)
(b)
(c)

Figura 2
Cromatogramas MRM de once analitos. reína (1), emodina (2), glucósido de estilbeno (3), ácido glicirrícico (4), liquiritina (5), liquiritigenina (6), isoliquiritigenina (7), ononina (8), verbascósido (9), ácido gálico (10), esquisandrina (11) e IS (12). (a) Plasma en blanco; (b) plasma en blanco enriquecido con los analitos e IS; (c) muestra de plasma tras la administración oral del extracto de TMYX.
3.3.2. Los resultados de las curvas de calibración, los rangos lineales, los coeficientes de correlación y los LLOQ se muestran en la Tabla 2. Las curvas de calibración del plasma se construyeron dentro del rango de 8-2000 ng/mL para el ácido glicirrícico; 4-1000 ng/mL para la liquiritina; 0,8-200 ng/mL para la emodina, el ácido gálico, la ononina, la esquisandrina y el glucósido de estilbeno; 0,4-100 ng/mL para la isoliquiritigenina, la liquiritigenina, la reína y el verbascósido.

Compuestos Curvas de calibración Correlación coeficientes (r) Rango lineal (ng/mL) LLOQ (ng/mL)
rhein y = 0.0954 x + 1,5911 0,9966 0,4 – 100 0,4
emodin y = 1,2189 x + 0,0135 0.9906 0,8 – 200 0,8
glicósido de estilbeno y = 6,6409 x + 0,0293 0.9991 0,8 – 200 0,8
ácido gálico y = 0,9987 x + 0,0104 0,9987 0.8 – 200 0,8
ononina y = 5,4632 x + 0,0058 0,9995 0,8 – 200 0.8
verbascosa y = 0,3514 x + 1,9984 0,9965 0,4 – 100 0.4
liquiritina y = 1,1970 x + 0,0085 0,9965 4 – 1000 4
schisandrin y = 2.5769 x + 0,0020 0,9980 0,8 – 200 0,8
liquiritigenina y = 2.2148 x + 0,0140 0,9997 0,4 – 100 0,4
ácido glicirrícico y = 0.0917 x – 0,0028 0,9982 8 – 2000 8
isoliquiritigenina y = 3,1496 x + 0,0064 0,9986 0,4 – 100 0.4
Tabla 2
Curvas de calibración, coeficientes de correlación, rangos lineales y LLOQ de los analitos.

Los LLOQ de 11 analitos en la muestra de plasma fueron inferiores a 8 ng/mL, que son suficientemente sensibles para los estudios farmacocinéticos.

3.3.3. Precisión y exactitud

En este ensayo se analizó la precisión y exactitud intra e interdiaria en tres niveles de concentración en seis réplicas. Los datos se mostraron en la Tabla 3. La RSD de la precisión intra e interdiaria estuvo entre el 0,7 y el 9,3%. El RE de la exactitud estuvo dentro de ±14,0%. Los resultados sugieren que el método es preciso y repetible para el análisis de todos los analitos en plasma de rata.

compuestos Concentración de la muestra (ng/mL) Intra-día Entre días
Concentración medida (ng/mL) Exactitud (RE, %) Precisión (RSD, %) Concentración medida (ng/mL) Exactitud (RE, %) Precisión (RSD, %)
rhein 1 1.00±0.01 0.5 1.2 0.99±0.01 -1.0 1.0
10 10.16±0.52 1.6 5.1 10.04±0.34 0.5 3.4
100 106.60±1,52 6,6 1,4 101,83±4,74 1,8 4,7
emodina 2 2,01±0,10 0.3 4.9 2.00±0.05 0.1 2.7
20 21.72±0.57 8.6 2.6 20.47±1.23 2.3 6.0
200 208.21±1.71 4.1 0.8 201.43±8.99 0.7 4.5
glicósido de estilbeno 2 1,99±0,06 -0,4 3,0 2,05±0,03 2,3 1.6
20 20.17±0.76 0.8 3.8 19.91±0.73 -0.5 3.7
200 192.33±2,26 -3,8 1,2 192,80±6,57 -3,6 3,4
ácido gálico 2 1,96±0.05 -2.0 2.6 2.06±0.05 3.1 2.4
20 20.00±0.31 0.1 1.6 20.27±0.61 1.4 3.0
200 186.32±1.66 -6.8 0.9 188.68±3.27 -5.7 1,7
ononina 2 1,96±0,04 -1,9 2,0 1,95±0,03 -2,6 1.4
20 20.59±0.88 3.0 4.3 19.62±1.09 -1.9 5.6
200 208.21±1,71 4,1 0,8 202,11±5,92 1,1 2,9
verbascósido 1 0,92±0,01 -7.8 1.5 0.96±0.03 -3.9 3.6
10 9.82±0.36 -1.8 3.7 9.66±0.13 -3.4 1.4
100 102.66±2.89 2.7 2.8 102.03±3.01 2.0 3.0
liquiritina 10 9,45±0,08 -5,5 0,8 9,89±0,49 -1,1 4.9
100 110.26±3.44 10.3 3.1 109.58±2.85 9.6 2.6
1000 1015.89±23,42 1,6 2,3 990,69±29,65 -0,9 3,0
schisandrin 2 2,00±0.04 0.2 2.0 1.89±0.06 -5.4 3.4
20 21.49±0.50 7.5 2.3 20.63±0.70 3.2 3.4
200 199.93±2.23 -0.1 1.1 197.48±3.11 -1,3 1,6
liquiritigenina 1 0,86±0,01 -14,0 1,4 0,93±0,08 -6.5 8.5
10 10.37±0.96 3.7 9.3 9.41±0.50 -5.9 5.3
100 106.60±1,52 6,6 1,4 98,95±7,06 -1,1 7,1
ácido glicirrícico 20 18.72±0.53 -0.1 2.8 19.21±0.49 -4.0 2.6
200 218.30±1.48 0.1 0.7 199.59±15.20 -0.2 7.6
2000 2123.83±59.62 0.1 2.8 1980,71±75,51 -1,0 3,8
isoliquiritigenina 1 0,98±0,02 -2,1 2.1 0.98±0.01 -1.6 1.5
10 9.82±0.14 -1.8 1.5 9.72±0.18 -2.8 1.8
100 99.74±0.87 -0.3 0.9 100.71±3.08 0.7 3.1
Tabla 3
Precisión y exactitud de 11 analitos en plasma de rata (n=6). Recuperación de la extracción y efecto de la matriz

Todos los datos de la recuperación de la extracción y el efecto de la matriz se resumieron en la Tabla 4. La recuperación de la extracción de 11 ingredientes en tres niveles de concentración estuvo en el ámbito del 85,2-109,1%. Los efectos de la matriz de todos los analitos oscilaron entre el 89,2 y el 113,4%. Los datos que manifiestan el procedimiento del experimento es eficiente y los efectos de la matriz podrían ser ignorados.

Compuestos Concentración de la muestra (ng/mL) Recuperación de la extracción (%) RSD (%) Efecto de la matriz (%) RSD (%)
rhein 1 96.2±7.4 7.7 104.1±5.6 5.4
10 99.3±3.9 3.9 100.1±2.7 2.7
100 101.4±5.2 5.1 92.6±3.7 4,0
emodina 2 98,8±3,4 3,5 107,7±2,6 2.4
20 96.2±2.5 2.6 103.6±0.8 0.8
200 86.1±4,2 4,9 104,8±2,9 2,8
glicósido de estilbeno 2 98.9±1.9 1.9 100.7±2.2 2.2
20 99.3±4.0 4.0 94.6±2.2 2.3
200 96.7±5.6 5.8 98.7±0.8 0.9
Ácido gálico 2 99,1±3,1 3,2 110,4±5,8 5.2
20 100.9±2.5 2.5 98.3±2.0 2.0
200 85.2±3,0 3,5 108,1±1,3 1,2
ononina 2 91,8±2.7 2.9 98.6±2.8 2.8
20 89.0±3.8 4.3 89.9±0.7 0.8
200 93.1±5.2 5.6 91.7±0.9 1.0
verbascósido 1 93,1±4,0 4,3 103,6±3,3 3.1
10 97.0±4.7 4.8 100.0±2.1 2.1
100 92.5±6,1 6,6 98,9±2,3 2,4
liquiritina 10 105.7±4.5 4.3 98.8±1.2 1.2
100 109.1±4.0 3.6 100.1±6.4 6.4
1000 99.5±7.6 7.7 95.2±5,5 5,8
schisandrin 2 98,8±4,1 4,2 96.8±2.6 2.7
20 106.3±1.1 1.0 93.0±1.7 1.8
200 101.0±6.0 5.9 90.4±0.7 0.8
liquiritigenina 1 99,7±3,5 3,6 113,4±2,8 2,5
10 99.5±2.7 2.7 89.2±1.3 1.5
100 96.3±3.4 3.5 99,8±1,8 1,8
ácido glicirrícico 20 100,9±7,5 7.4 101.6±6.8 6.7
200 97.5±2.1 2.1 102.5±1.3 1.3
2000 87.6±1.6 1.8 103.7±2.1 2.0
isoliquiritigenina 1 98,0±5,5 5,6 105,73±2,2 2.1
10 96.5±2.0 2.1 98.0±3.6 3.6
100 85.9±5.7 6.7 97.3±3.1 3.2
Tabla 4
Recuperaciones de la extracción y efectos de la matriz de los analitos (n=6).

3.3.5. Estabilidad

Para investigar la estabilidad de los analitos, se ensayaron muestras de QC de tres niveles de concentración bajo las diferentes condiciones de almacenamiento, incluyendo el almacenamiento en el automuestreador durante 12 h después de la preparación, a temperatura ambiente durante 6 h, a tres ciclos de congelación y descongelación, y a -70°C durante 14 días. Como se muestra en la Tabla 5, los resultados sugieren que los analitos son estables en las condiciones anteriores.

Compuestos Concentración de la muestra (ng/mL) Temperatura ambiente durante 6 h tres ciclos de congelación-descongelación auto-muestreador durante 12 h -.70°C durante 14 días
Concentración medida (ng mL-1) RSD (%) Concentración medida (ng mL-1) RSD (%) Concentración medida Concentración (ng mL-1) RSD (%) Concentración medida (ng mL-1) RSD (%)
rhein 1 0.97±0.02 2.0 0.98±0.03 2.8 0.97±0.01 0.8 0.95±0.05 5.4
10 10.23±0.04 0.4 8.89±0.08 0.9 9.86±0.09 0.9 8.71±0.11 1.3
100 101.97±1.07 1.1 86.7±1.33 1.5 97.32±1.05 1.1 85.95±0.39 0.5
emodina 2 1,95±0,05 2,3 2,00±0,02 0.9 1.93±0.02 0.8 1.86±0.03 1.6
20 21.14±0.99 4.7 19.21±0.33 1.7 19.88±1.81 9.1 18.79±0.18 0.9
200 207.49±1.27 0.6 197.74±5.65 2.9 200.50±11.66 5.8 185.45±0.98 0.5
glicósido de estilbeno 2 1,82±0,01 0,8 2.00±0.03 1.6 1.89±0.00 0.1 1.99±0.01 0.3
20 20.88±1.19 5.7 19.87±1.43 7.2 19.00±0.64 3.4 20.01±0.31 1.6
200 202.79±12.80 6.3 200.45±2.10 1.1 182.40±1.23 0.7 203.34±1,39 0,7
Ácido gálico 2 1,97±0,03 1.5 1.93±0.04 1.8 2.03±0.05 2.3 1.99±0.04 2.0
20 20.77±1.09 5.3 20.08±0.51 2.5 19.27±0.35 1.8 19.26±0.22 1.2
200 205.97±2.14 1.0 196.77±1.09 0.6 184.54±2.46 1.3 199.19±1,80 0,9
ononina 2 2,02±0,03 1.4 1.85±0.01 0.7 1.83±0.01 0.4 1.95±0.01 0.5
20 20.57±0.26 1.2 18.71±0.26 1.4 18.84±0.62 3.3 18.51±0.15 0.8
200 216.32±0.91 0.4 191.28±2.36 1.2 195.34±4.30 2.2 200,23±3,89 1,9
verbascósido 1 0,92±0.01 1.0 1.09±0.01 0.9 1.05±0.02 1.8 1.01±0.02 2.3
10 9.57±0.21 2.2 10.17±0.90 8.9 9.50±0.04 0.5 9.81±0.22 2.2
100 103.95±1.33 1.3 108.42±1.17 1.1 93.52±0.27 0,3 107,40±1,47 1,4
liquiritina 10 9.85±0.09 1.0 9.26±0.16 1.7 10.26±0.11 1.1 10.04±0.12 1.2
100 108.97±1.51 1.4 109.67±1.86 1.7 108.02±0.66 0.6 105.05±1.73 1.7
1000 1076.07±10.27 1.0 952.89±11.22 1.2 869.12±14.52 1.7 1021.69±19.98 2.0
schisandrin 2 2,00±0,04 1,8 1,71±0,01 0.6 1.83±0.02 1.1 1.77±0.03 1.7
20 21.15±0.50 2.4 18.28±0.23 1.2 18.35±0.09 0.5 17.86±0.20 1.1
200 194.61±1.13 0.6 189.32±1.74 0.9 196.02±2.10 1.1 183.83±1.00 0.6
liquiritigenina 1 0,87±0,01 0,9 0,89±0,02 1.8 0.87±0.01 1.1 0.88±0.02 2.1
10 10.82±0.58 5.3 8.99±0.07 0.8 8.63±0.23 2.7 9.26±0.08 0.9
100 112.69±1.30 1.2 92.59±0.63 0.7 92.65±0.68 0.7 91.88±0.86 0.9
Ácido glicirrícico 20 20,49±0,79 3,9 19.30±0.20 1.0 19.25±0.34 1.8 18.77±0.09 0.5
200 203.22±3.32 1.6 188.63±3.57 1.9 200.96±3.93 2.0 200.33±2.98 1.5
2000 2099.10±8.92 0.4 1869.00±42.55 2.3 1884.66±9.26 0.5 1834.54±29,34 1,6
isoliquiritigenina 1 0,99±0.01 1.5 0.89±0.02 2.4 1.00±0.02 1.7 0.89±0.01 1.4
10 10.86±0.60 5.5 8.69±0.14 1.6 9.60±0.04 0.4 8.62±0.04 0.4
100 106.11±0.78 0.7 100.58±0.91 0.9 97.47±1.99 2.0 100,74±2,95 2,9
Tabla 5
Estabilidad de todos los analitos en plasma de rata (n=6).
3.4. Estudio farmacocinético

El método LC-MS/MS validado se aplicó al estudio farmacocinético de los once analitos en muestra de sangre de rata tras la administración oral de TMYX en una dosis única de 8,3 g/kg. Los principales parámetros farmacocinéticos se demostraron en la Tabla 6. Y los perfiles medios de concentración plasmática-tiempo de los once principios activos se mostraron en la Figura 3.

Compuestos Tmax1 (h) Tmax2 (h) Cmax1 (ng/mL) . Cmax2 (ng/mL) t1/2 (h) Ke (1/h) (h-ng/mL) (h-ng/mL)
rhein 0.36±0.31 46.3±15.6 2.84±2.13 0.56±0.50 145.0±52,6 152,1±61,3
emodina 0,32±0,14 88.0±37.5 4.21±2.63 0.39±0.28 475.5±121.0 561.3±192,3
glicósido de estilbeno 0,50±0,31 99.1±27.1 1.99±1.31 0.45±0.24 283.8±189.1 297.5±185,3
liquiritina 0,50±0,46 199,9±120.2 2.16±1.44 0.77±0.54 637.2±220.2 651.1±219.5
ononina 0,46±0,10 14,4±6,8 2.85±1,40 0,37±0,25 58,2±20,2 69,4±28,5
verbascósido 0.37±0.18 23.4±8.7 1.53±0.67 0,56±0,31 51,4±29,8 61,0±29,8
ácido gálico 0.75±0.67 56.9±42.8 3.01±1.35 0.27±0.12 214,7±136,7 238,4±172,8
schisandrin 1,00±0.92 92.6±53.0 2.73±1.54 0.34±0.19 410.8±238,9 473,4±321,2
liquiritigenina 0,20±0,07 7.20±3.35 37.8±24.1 21.0±15.3 12.70±7.04 0.50±0.34 314,8±129,8 332,6±142,1
ácido glicirrícico 2,13±1.44 17.67±10.31 351.7±347.4 476.1±146.0 18.19±9.61 0.05±0,03 12743,5±5058,2 17327,3±10967,3
isoliquiritigenina 0.28±0.11 7.00±2.45 41.6±24.2 24.9±13.5 13.46±8.33 0.07±0.04 410.0±130.7 436.2±154.1
Tabla 6
Parámetros farmacocinéticos de 11 analitos tras la administración oral de extracto de TMYX (n=6).
Figura 3
Curvas de concentración plasmática-tiempo media de rhein, emodin, stilbene glycoside liquiritina, ononina, verbascósido, ácido gálico, esquisandrina, liquiritigenina, ácido glicirrícico y isoliquiritigenina tras la administración oral del extracto de TMYX (media ± SD, n=6).

La Tmáx de la reína, la emodina, el glucósido de estilbeno, la liquiritina, la ononina, el verbascósido, el ácido gálico y la esquisandrina son 036±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h y 1,00±0,92 h, respectivamente. La Tmáx muestra que ocho ingredientes se absorben rápidamente. Se detectan picos dobles en los perfiles de concentración plasmática-tiempo medios para la liquiritigenina, el ácido glicirrícico y la isoliquiritigenina. El primer pico de tres ingredientes apareció a las 0,20 h, 2,13 h y 0,28 h y el segundo pico a las 7,20 h, 17,67 h y 7,00 h, respectivamente. Podría ser el resultado de la circulación hepatoenteral. En el plasma de las ratas se informó de un perfil de concentración plasmática máxima de liquiritigenina, isoliquiritigenina y ácido glicirrícico tras la administración oral de Radix glycyrrhizae o de la combinación de Radix glycyrrhizae y Ramulus cinnamomi . Las diferencias pueden provenir de los efectos de otras hierbas en el TMYX, que requieren más experimentos. Además de los picos dobles, la vida media de eliminación (t1 /2) de la reína, la emodina, el ácido gálico, la glicirricina, el estilbeno glicósido, el verbascósido, la formononetina y la esquizandrina oscilan entre 1,53 h y 4,21 h, lo que sugiere que estos ocho analitos en la muestra de sangre de rata se eliminan rápidamente tras su administración oral. Se informó de una tendencia farmacocinética similar de la schisandrina tras la administración oral del extracto acuoso de Fructus schisandrae. También se informó que se observó un pico para la emodina y el ácido gálico en ratas que recibieron dosis de Radix polygoni multiflori . Las t1 /2 de la liquiritigenina, el ácido glicirrícico y la isoliquiritigenina son 12,70 h, 18,19 h y 13.46 h, lo que indica que el ingrediente tiene un tiempo de tratamiento más largo, especialmente la isoliquiritigenina y el ácido glicirrícico, que todavía pueden detectarse in vivo a las 48 h.

4. Conclusión

En nuestro experimento, desarrollamos un método de HPLC-MS/MS para detectar la reína, la emodina, el glucósido estilbeno, la liquiritina, la ononina, el verbascósido, el ácido gálico, la esquisandrina, la liquiritigenina, el ácido glicirrícico y la isoliquiritigenina en el plasma de ratas. Los parámetros farmacocinéticos serían útiles para el posterior desarrollo y uso en la clínica de TMYX. Los 11 principios activos de TMYX, que se absorbieron en el plasma, proporcionarían datos de apoyo para la mejora del control de calidad.

Disponibilidad de los datos

Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio están disponibles a petición del autor correspondiente.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81673824 y 81503457) y el Proyecto de Investigación de la Comisión Municipal de Educación de Tianjin (2017KJ139).

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