Sviluppo di un metodo HPLC-MS/MS per determinare 11 composti bioattivi nella pillola Tongmai Yangxin e applicazione a uno studio farmacocinetico nei ratti

Abstract

Un metodo HPLC-MS/MS sensibile e affidabile è stato sviluppato e validato per la determinazione simultanea di undici composti bioattivi (reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrina, liquiritigenina, acido glicirrizico e isoliquiritigenina) nel plasma di ratto dopo somministrazione orale della pillola Tongmai Yangxin. I campioni di plasma raccolti sono stati preparati mediante estrazione liquido-liquido con acetato di etile dopo acidificazione. Undici composti sono stati separati su una colonna CORTECS™ C18 con fasi mobili costituite da acido formico allo 0,1% in acqua deionizzata e acetonitrile. La velocità di flusso era di 0,3 mL/min. La rilevazione è stata eseguita su un sistema di massa tandem con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) in ionizzazione sia positiva che negativa utilizzando la modalità di monitoraggio a reazione multipla (MRM). Le curve di calibrazione erano lineari nell’intervallo di 8-2000 ng/mL per l’acido glicirrizico; 4-1000 ng/mL per la liquiritina; 0,8-200 ng/mL per emodina, acido gallico, ononina, schisandrin e glicoside stilbene; 0,4-100 ng/mL per isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascoside, rispettivamente. La precisione intra- e intergiornaliera degli analiti era inferiore al 9,3% e all’8,5%. L’accuratezza intra- e intergiornaliera era nell’intervallo di -14,0% a 10,3% e -6,5% a 9,6%. Nel frattempo, il recupero dell’estrazione degli analiti nei campioni di plasma variava dall’85,2% al 109,1% e l’effetto matrice dall’89,2% al 113,4%. Il metodo sviluppato è stato applicato con successo alla farmacocinetica di undici composti bioattivi nel plasma di ratto dopo la somministrazione orale di Tongmai Yangxin Pill prescription.

1. Introduzione

La medicina tradizionale cinese (MTC) è un tesoro prezioso della natura. Le MTC sono state usate in ambito clinico per migliaia di anni e attirano sempre più attenzioni grazie al trattamento di diverse malattie con successo e con minimi effetti collaterali. La prescrizione della MTC, la forma più comunemente usata nella medicina clinica, ha multicomponenti e multitarget. I multicomponenti e i multitarget sono la superiorità e la caratteristica delle azioni farmacologiche della MTC.

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) è una medicina tradizionale cinese documentata nella farmacopea cinese. La prescrizione è stata sviluppata da una nota coppia di erbe “GuiZhi-GanCao” documentata in “Shang-Han-Lun” da Zhongjing Zhang nella dinastia Han orientale. La prescrizione consiste di undici erbe tra cui Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis, e Fructus jujubae . Il TMYX è stato usato per trattare la malattia coronarica, l’aritmia, il dolore al petto e l’angina per diversi decenni. I moderni studi farmacologici dimostrano che TMYX ha un effetto significativo sulle malattie cardiache. Quattro composti flavonoidi attivi (glicasperina A, glicumarina, licorisoflavan A e licoisoflavone A) di TMYX sono risultati avere un’attività biologica soddisfacente e promuovere la proliferazione e l’angiogenesi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana nello zebrafish. Nel frattempo, Liu et al. hanno riferito che cinque frazioni di TMYX sono risultate esercitare un’attività di transizione antiepiteliale-mesenchimale. I risultati di Tao hanno indicato che sei principi attivi con alti valori R (gomisina D, schisandrina, acido glicirrizico, glicoside stilbene, formononetina e ononina) esercitano effetti antinfiammatori in modo dose-dipendente. Chen ha riportato 80 composti identificati o ipotizzati utilizzando HPLC-MS, compresi 23 flavoni e i loro glucuronidi, 6 glicosidi fenilalcolici, 20 saponine triterpeniche, 15 lignani e 18 altri composti. Fan ha caratterizzato 40 componenti bioattivi assorbiti dopo la somministrazione orale di TMYX nel siero di ratto tramite UPLC/Q-TOF-MS. I 40 componenti includono 2 da Radix rehmanniae, 10 da Radix codonopsis, 2 da Radix ophiopogonis, 2 da Ramulus cinnamomi, 19 da Radix glycyrrhizae, 2 da Radix polygoni multiflori preparata, 5 da Caulis spatholobi, 1 da Fructus jujubae, e 1 da Fructus schisandrae, alcuni dei quali sono sovrapposti. La maggior parte degli ingredienti esercita effetti antinfiammatori e antiossidanti, esercitando inoltre l’effetto protettivo cardiovascolare. Il team determina anche le concentrazioni di liquiritina, liquiritigenina, isoliquiritigenina, acido glicirrizico e acido glicirretinico nel plasma di ratto dopo la somministrazione orale di Radix glycyrrhizae o la combinazione di Radix glycyrrhizae e Ramulus cinnamomi da HPLC-UV. Tuttavia, non c’è nessuna pubblicazione che riporta lo studio farmacocinetico di TMYX.

La farmacocinetica (PK) delle MTC è una branca della farmacologia delle MTC. La PK delle MTC si concentra sullo studio quantitativo delle leggi di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione dei farmaci in un organismo vivente. Lo studio PK dei multicomponenti della prescrizione di MTC è stato uno degli aspetti di ricerca importanti della modernizzazione delle MTC. I dati PK potrebbero chiarire la base della sostanza e rivelare la connotazione scientifica delle MTC. Svolge anche un ruolo importante nella creazione di nuove medicine cinesi, nel miglioramento delle forme di dosaggio e nel meccanismo di formulazione. Nel presente studio, un metodo affidabile e sensibile HPLC-MS/MS è stato prima sviluppato e applicato allo studio farmacocinetico di 11 componenti bioattivi tra cui reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrina, liquiritigenina, acido glicirrizico e isoliquiritigenina nei ratti dopo somministrazione orale di TMYX. Sono state rivelate le caratteristiche farmacocinetiche dei principali componenti chimici di TMYX nei ratti, che fornirebbero una base teorica per l’uso di TMYX in clinica.

2. Sperimentale

2.1. Prodotti chimici, reagenti e materiali

Metanolo (purezza cromatografica) e acetonitrile (purezza cromatografica) sono stati acquistati da Merck Co. L’acido formico (purezza cromatografica) è stato ottenuto da ROE Co. L’acqua ultrapura è stata preparata con un sistema di purificazione dell’acqua Milli-Q (Millipore, Milford, MA, USA). Reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrin, liquiritigenina, acido glicirrizico, isoliquiritigenina, e icariina sono stati acquistati da Chengdu Must Bio-Technology Co. Ltd. (Chengdu, Cina). TMYX sono stati forniti da Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Condizioni cromatografiche e spettrometria di massa

Il sistema HPLC-MS/MS consiste in una cromatografia liquida ad alte prestazioni Agilent 1200 accoppiato con un Aglient 6430 serie triplo quadrupolo spettrometro di massa con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI). La separazione cromatografica è stata ottenuta su una colonna CORTECS C18 (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), e la temperatura della colonna è stata mantenuta a 30°C. Le fasi mobili costituite da acido formico allo 0,1% in acqua (A) e acetonitrile (B) sono state utilizzate nel seguente metodo di eluizione a gradiente: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. La velocità di flusso è stata impostata a 0,3 mL/min, e il volume di iniezione era 10 μL. Tutti i dati sono stati analizzati dal software della workstation Mass Hunter (Agilent Technologies, USA).

Lo spettrometro di massa è stato eseguito in modalità di monitoraggio a reazione multipla (MRM) a ionizzazione positiva e negativa. I parametri della sorgente erano i seguenti: la tensione capillare era impostata a 300 V per la modalità di ionizzazione positiva e -300 V per la modalità di ionizzazione negativa, la temperatura del gas di essiccamento era di 320°C, il flusso era di 11 L/min e la pressione del gas di nebulizzazione era di 30 psi. Il precursore e la produzione degli ingredienti e i parametri MRM sono stati visualizzati nella tabella 1.

2.3. Preparazione dell’estratto di TMYX

L’estratto di TMYX è stato preparato come segue: Un totale di 100 g di polvere di TMYX è stato accuratamente pesato ed estratto due volte sotto riflusso di calore con quattro volte quantità di etanolo al 60% (v/v) per 1 ora per volta. Dopo di che, le soluzioni di estrazione sono state filtrate e mescolate. La soluzione mista è stata concentrata per evaporazione sotto pressione ridotta. Poi gli estratti secchi sono stati ridotti in polvere e tenuti in un essiccatore fino all’analisi. Gli estratti contengono reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrin, liquiritigenina, acido glicirrizico, e isoliquiritigenina 0.4, 46.3, 231.6, 270.5, 161.1, 27.8, 71.8, 65.2, 16.9, 519.7, e 9.6 μg/g, rispettivamente. Le strutture dei composti nello studio sono state mostrate nella Figura 1.

Figura 1

Strutture chimiche di undici componenti.

2.4. Preparazione delle soluzioni di calibrazione e dei campioni di controllo qualità

Per fare la soluzione stock, reina, emodina, stilbene glicoside, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrina, liquiritigenina, acido glicirrizico, isoliquiritigenina, e icariina (soluzione standard interna) sono stati pesati separatamente e diluiti con metanolo ad una concentrazione finale di 1 mg/mL. La soluzione standard mista è stata ottenuta mescolando un volume appropriato di undici soluzioni stock e diluite con metanolo.

Le soluzioni di calibrazione sono state preparate mescolando 20 μL della soluzione standard mista e 20 μL di IS in 100 μL di plasma di ratto vuoto. Le concentrazioni finali degli analiti serie erano al range di 8-2000 ng/mL per l’acido glicirrizico; 4-1000 ng/mL per liquiritin; 0,8-200 ng/mL per emodina, acido gallico, ononin, schisandrin e glicoside stilbene; e 0,4-100 ng/mL per isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein e verbascoside.

Campioni di controllo di qualità (QC) a tre concentrazioni (bassa, media e alta concentrazione) sono stati composti da soluzioni standard miste appropriate con campione di sangue bianco come soluzioni di calibrazione per soddisfare le concentrazioni richieste. Tutte le soluzioni sono state conservate a 4°C.

2.5. Preparazione del campione di plasma

Il plasma (100 μL) è stato addizionato con 20 μL di metanolo, 20 μL di IS (icariina, 1 μg/mL) e 20 μL di acido formico e poi miscelato al vortex. La miscela è stata estratta con 800 μL di acetato di etile mescolando al vortex per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione a 14.000 rpm per 10 min, il surnatante è stato raccolto in un tubo pulito ed evaporato a secco sotto un flusso di azoto. Il residuo è stato ricostituito in 50 μL di metanolo al 50%, vortexato per 5 min, e centrifugato a 14.000 rpm per 10 min. Infine, 10 μL di surnatante sono stati iniettati nel sistema LC-MS/MS per l’analisi.

2.6. Convalida del metodo

2.6.1. Specificità

La specificità è stata valutata analizzando campioni di sangue bianco da sei diversi ratti. Ogni campione di plasma è stato valutato per l’interferenza endogena utilizzando il programma di estrazione suggerito e le condizioni LC-MS/MS di cui sopra.

2.6.2. Linearità e LLOQ

La linearità è stata raggiunta analizzando il plasma di ratto bianco con una serie di soluzioni standard miste e IS in duplicato per 3 giorni consecutivi. Le curve di calibrazione sono state tracciate dai rapporti picco-area (y) dell’analita contro lo standard interno rispetto alla concentrazione nominale (x). Il fattore di peso è 1/x. Il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) è stato valutato in base al rumore della linea di base, definendo un rapporto segnale-rumore di circa 10.

2.6.3. Precisione e accuratezza

La precisione e l’accuratezza sono state valutate determinando campioni QC a livelli di concentrazione bassi, medi e alti (20, 200 e 2000 ng/mL per l’acido glicirrizico; 10, 100 e 1000 ng/mL per la liquiritina; 2, 20 e 200 ng/mL per emodina, acido gallico, ononina, schisandrina e glicoside stilbene; 1, 10 e 100 ng/mL per isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascoside). Tutti i livelli di concentrazione sono stati misurati in sei repliche. La precisione e l’accuratezza sono state testate una volta al giorno e ripetute per 3 giorni consecutivi con la curva di calibrazione standard. La precisione intra- e intergiornaliera è stata definita come la deviazione standard relativa (RSD), mentre l’accuratezza è stata determinata dall’errore relativo (RE %).

2.6.4. Il recupero dell’estrazione e l’effetto matrice

Il recupero dell’estrazione di undici analiti a tre livelli di concentrazione e l’IS sono stati valutati confrontando le aree dei picchi ottenuti dai campioni estratti con quelle dei campioni postestratti. L’effetto matrice dei campioni e l’IS sono stati stimati dai rapporti delle aree di picco degli analiti nei campioni con spuntini post-trattati rispetto a quelli ottenuti dai campioni non estratti. Sia il recupero dell’estrazione che l’effetto matrice sono stati testati in sei paralleli.

2.6.5. Stabilità

La stabilità degli analiti nei campioni di plasma è stata determinata analizzando campioni QC di tre livelli di concentrazione in diverse condizioni: conservati all’autocampionatore per 12 ore, a temperatura ambiente per 6 ore, sotto tre cicli di congelamento-disgelo e conservati a -70°C per 14 giorni. Tutti gli studi di stabilità sono stati misurati in sei repliche.

2.7. Studio farmacocinetico

I ratti maschi Sprague-Dawley (230-250 g) sono stati ottenuti da Beijing HFK Experimental Animal Technology Co. I ratti sono stati mantenuti in condizioni ambientali di controllo e hanno digiunato per 12 ore con libero accesso all’acqua prima degli esperimenti. Gli estratti di TMYX sono stati dissolti in CMC-Na e somministrati per via orale ai ratti a 8,3 g/kg. I campioni di sangue (200 μL) sono stati raccolti dalla vena della fossa orbitale del ratto a 0, 0.03, 0.083, 0.17, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 e 48 ore dopo la somministrazione orale in provette eparinizzate. Poi i campioni di sangue sono stati centrifugati a 7.000 rpm per 10 minuti per ottenere immediatamente il campione di plasma. Infine, il plasma ottenuto è stato conservato a -70°C fino all’analisi. I parametri farmacocinetici sono stati calcolati dal programma per computer “Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, China).

3. Risultato e discussione

3.1. Metodo HPLC-MS/MS

Sono state testate diverse fasi mobili. Confrontando con un sistema di fase mobile gradiente con acetonitrile-acqua o metanolo-acqua, la fase mobile contiene 0,1% di acido formico in acqua potrebbe migliorare la forma del picco e aumentare la risposta del segnale degli analiti. Così, abbiamo scelto l’acqua contenente lo 0,1% di acido formico come fase mobile.

Le soluzioni standard degli analiti e lo standard interno sono stati iniettati nello spettrometro di massa, rispettivamente. L’ononina e la schisandrina sono state analizzate in modalità ione positivo, mentre le altre in negativo. Le transizioni precursore-prodotto ottimizzate sono state monitorate a 238.9→211.0 per la reina, 269.0→225.0 per l’emodina, 405.2→242.8 per il glicoside stilbene, 417.1→255.0 per la liquiritina, 431.2→269.1 per la ononina, 623.0→161.1 per il verbascoside, 169.0→125.1 per l’acido gallico, 433.3→384.2 per la schisandrina, 255.3→119.1 per la liquiritigenina, 821.1→350.5 per l’acido glicirrizico, 255.1→118.9 per l’isoliquiritigenina, e 721.0→513.2 per IS. Tutti i dati sono stati riportati nella tabella 1.

3.2. Preparazione del campione

Nell’esperimento, abbiamo testato due metodi per smaltire il campione di plasma tra cui l’estrazione liquido-liquido (LLE) e la precipitazione delle proteine (PPT). I risultati mostrano che sia il recupero che gli effetti matrice dei metodi soddisfano i requisiti per la determinazione di campioni biologici e le sostanze endogene non interferiscono con l’analisi. Tuttavia, il metodo di PPT ha mostrato un’efficienza di estrazione inferiore e un effetto matrice più alto relativamente. Di conseguenza, abbiamo selezionato l’estrazione liquido-liquido (LLE) con acetato di etile per preparare il campione.

3.3. Convalida del metodo

3.3.1. Specificità

La specificità è stata stimata confrontando i cromatogrammi di campioni di sangue in bianco di sei diversi ratti con campioni di sangue contenenti analiti. I cromatogrammi rappresentativi del campione di sangue bianco, del campione di sangue bianco contenente undici analiti e IS, e del campione di plasma ottenuto da un ratto dopo la somministrazione orale di estratti di TMYX sono stati accessibili. Il tempo di ritenzione di reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrina, liquiritigenina, acido glicirrizico, isoliquiritigenina, e IS erano 15.93, 17.63, 11.34, 11.31, 12.21, 11.01, 6.48, 16.41, 13.21, 13.34, 14.41, e 12.19 min, rispettivamente. Sulla base dei cromatogrammi, le sostanze endogene nei campioni di plasma non interferiscono con la determinazione degli analiti e dell’IS. I cromatogrammi sono stati mostrati nella figura 2.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

Cromatogrammi MRM di undici analiti. reina (1), emodina (2), glicoside stilbene (3), acido glicirrizico (4), liquiritina (5), liquiritigenina (6), isoliquiritigenina (7), ononina (8), verbascoside (9), acido gallico (10), schisandrin (11), e IS (12). (a) Plasma bianco; (b) plasma bianco addizionato con gli analiti e IS; (c) campione di plasma dopo la somministrazione orale dell’estratto TMYX.

3.3.2. Linearità e sensibilità

I risultati delle curve di calibrazione, gli intervalli lineari, i coefficienti di correlazione e gli LLOQ sono stati visualizzati nella tabella 2. Le curve di calibrazione del plasma sono state costruite all’interno dell’intervallo di 8-2000 ng/mL per l’acido glicirrizico; 4-1000 ng/mL per liquiritina; 0,8-200 ng/mL per emodina, acido gallico, ononina, schisandrin e glicoside stilbene; 0,4-100 ng/mL per isoliquiritigenina, liquiritigenina, reina e verbascoside.

Composti Curve di calibrazione Coefficienti di correlazione coefficienti (r) Campo lineare (ng/mL) LLOQ (ng/mL) rhein y = 0.0954 x + 1,5911 0,9966 0,4 – 100 0,4 emodin y = 1,2189 x + 0,0135 0.9906 0,8 – 200 0,8 glicoside stilbene y = 6,6409 x + 0,0293 0.9991 0,8 – 200 0,8 acido gallico y = 0,9987 x + 0,0104 0,9987 0.8 – 200 0,8 ononina y = 5,4632 x + 0,0058 0,9995 0,8 – 200 0.8 verbascoside y = 0,3514 x + 1,9984 0,9965 0,4 – 100 0.4 liquiritina y = 1,1970 x + 0,0085 0,9965 4 – 1000 4 schisandrin y = 2.5769 x + 0,0020 0,9980 0,8 – 200 0,8 liquiritigenina y = 2.2148 x + 0,0140 0,9997 0,4 – 100 0,4 acido glicirrizico y = 0.0917 x – 0,0028 0,9982 8 – 2000 8 isoliquiritigenina y = 3,1496 x + 0,0064 0,9986 0,4 – 100 0.4

Tabella 2

Curve di calibrazione, coefficienti di correlazione, range lineari e LLOQ degli analiti.

I LLOQ per 11 analiti nel campione di plasma erano inferiori a 8 ng/mL, che sono abbastanza sensibili per gli studi farmacocinetici.

3.3.3. Precisione e accuratezza

In questo test, la precisione e l’accuratezza intra- e intergiornaliera sono state analizzate a tre livelli di concentrazione in sei replicati. I dati sono stati visualizzati nella tabella 3. La RSD della precisione intra- e intergiornaliera era compresa tra 0,7 e 9,3%. Il RE della precisione era entro il ±14,0%. I risultati suggeriscono che il metodo è accurato e ripetibile per l’analisi di tutti gli analiti nel plasma di ratto.

composti Concentrazione Spikeed (ng/mL) Intra-giorno Intergiorno Concentrazione misurata (ng/mL) Precisione (RE, %) Precisione (RSD, %) Concentrazione misurata (ng/mL) Accuratezza (RE, %) Precisione (RSD, %) rhein 1 1.00±0.01 0.5 1.2 0.99±0.01 -1.0 1.0 10 10.16±0.52 1.6 5.1 10.04±0.34 0.5 3.4 100 106.60±1.52 6.6 1.4 101.83±4.74 1.8 4.7 emodina 2 2.01±0.10 0.3 4.9 2.00±0.05 0.1 2.7 20 21.72±0.57 8.6 2.6 20.47±1.23 2.3 6.0 200 208.21±1.71 4.1 0.8 201.43±8.99 0.7 4.5 glicoside stilbene 2 1,99±0,06 -0,4 3,0 2,05±0,03 2,3 1.6 20 20.17±0.76 0.8 3.8 19.91±0.73 -0.5 3.7 200 192.33±2.26 -3.8 1.2 192.80±6.57 -3.6 3.4 acido gallico 2 1.96±0.05 -2.0 2.6 2.06±0.05 3.1 2.4 20 20.00±0.31 0.1 1.6 20.27±0.61 1.4 3.0 200 186.32±1.66 -6.8 0.9 188.68±3.27 -5.7 1.7 ononina 2 1.96±0.04 -1.9 2.0 1.95±0.03 -2.6 1.4 20 20.59±0.88 3.0 4.3 19.62±1.09 -1.9 5.6 200 208.21±1.71 4.1 0.8 202.11±5.92 1.1 2.9 verbascoside 1 0.92±0.01 -7.8 1.5 0.96±0.03 -3.9 3.6 10 9.82±0.36 -1.8 3.7 9.66±0.13 -3.4 1.4 100 102.66±2.89 2.7 2.8 102.03±3.01 2.0 3.0 liquiritina 10 9,45±0,08 -5,5 0,8 9,89±0,49 -1,1 4.9 100 110.26±3.44 10.3 3.1 109.58±2.85 9.6 2.6 1000 1015.89±23.42 1.6 2.3 990.69±29.65 -0.9 3.0 schisandrin 2 2.00±0.04 0.2 2.0 1.89±0.06 -5.4 3.4 20 21.49±0.50 7.5 2.3 20.63±0.70 3.2 3.4 200 199.93±2.23 -0.1 1.1 197.48±3.11 -1.3 1.6 liquiritigenina 1 0.86±0.01 -14.0 1.4 0.93±0.08 -6.5 8.5 10 10.37±0.96 3.7 9.3 9.41±0.50 -5.9 5.3 100 106.60±1.52 6.6 1.4 98.95±7.06 -1.1 7.1 acido glicirrizico 20 18.72±0.53 -0.1 2.8 19.21±0.49 -4.0 2.6 200 218.30±1.48 0.1 0.7 199.59±15.20 -0.2 7.6 2000 2123.83±59.62 0.1 2.8 1980.71±75.51 -1.0 3.8 isoliquiritigenina 1 0.98±0.02 -2.1 2.1 0.98±0.01 -1.6 1.5 10 9.82±0.14 -1.8 1.5 9.72±0.18 -2.8 1.8 100 99.74±0.87 -0.3 0.9 100.71±3.08 0.7 3.1

Tabella 3

Precisione e precisione di 11 analiti nel plasma di ratto (n=6).

3.3.4. Recupero dell’estrazione ed effetto matrice

Tutti i dati del recupero dell’estrazione e dell’effetto matrice sono stati riassunti nella tabella 4. Il recupero dell’estrazione di 11 ingredienti a tre livelli di concentrazione era nell’ambito dell’85,2-109,1%. Gli effetti matrice di tutti gli analiti variavano da 89,2 a 113,4%. I dati che manifestano la procedura dell’esperimento sono efficienti e gli effetti della matrice potrebbero essere ignorati.

Composti Concentrazione spikeed (ng/mL) Recupero estrazione (%) RSD (%) Effetto matrice (%) RSD (%) rhein 1 96.2±7.4 7.7 104.1±5.6 5.4 10 99.3±3.9 3.9 100.1±2.7 2.7 100 101.4±5.2 5.1 92.6±3.7 4.0 emodina 2 98.8±3.4 3.5 107.7±2.6 2.4 20 96.2±2.5 2.6 103.6±0.8 0.8 200 86.1±4.2 4.9 104.8±2.9 2.8 glicoside stilbene 2 98.9±1.9 1.9 100.7±2.2 2.2 20 99.3±4.0 4.0 94.6±2.2 2.3 200 96.7±5.6 5.8 98.7±0.8 0.9 acido gallico 2 99,1±3,1 3,2 110,4±5,8 5.2 20 100.9±2.5 2.5 98.3±2.0 2.0 200 85.2±3.0 3.5 108.1±1.3 1.2 ononina 2 91.8±2.7 2.9 98.6±2.8 2.8 20 89.0±3.8 4.3 89.9±0.7 0.8 200 93.1±5.2 5.6 91.7±0.9 1.0 verbascoside 1 93.1±4.0 4.3 103.6±3.3 3.1 10 97.0±4.7 4.8 100.0±2.1 2.1 100 92.5±6.1 6.6 98.9±2.3 2.4 liquiritina 10 105.7±4.5 4.3 98.8±1.2 1.2 100 109.1±4.0 3.6 100.1±6.4 6.4 1000 99.5±7.6 7.7 95.2±5.5 5.8 schisandrin 2 98.8±4.1 4.2 96.8±2.6 2.7 20 106.3±1.1 1.0 93.0±1.7 1.8 200 101.0±6.0 5.9 90.4±0.7 0.8 liquiritigenina 1 99,7±3,5 3,6 113,4±2,8 2,5 10 99.5±2.7 2.7 89.2±1.3 1.5 100 96.3±3.4 3.5 99.8±1.8 1.8 acido glicirrizico 20 100.9±7.5 7.4 101.6±6.8 6.7 200 97.5±2.1 2.1 102.5±1.3 1.3 2000 87.6±1.6 1.8 103.7±2.1 2.0 isoliquiritigenina 1 98.0±5.5 5.6 105.73±2.2 2.1 10 96.5±2.0 2.1 98.0±3.6 3.6 100 85.9±5.7 6.7 97.3±3.1 3.2

Tabella 4

Recuperi di estrazione ed effetti matrice degli analiti (n=6).

3.3.5. Stabilità

Per studiare la stabilità degli analiti, sono stati testati campioni QC di tre livelli di concentrazione in diverse condizioni di conservazione, compresi quelli conservati in autocampionatore per 12 ore dopo la preparazione, a temperatura ambiente per 6 ore, a tre cicli di congelamento-disgelo e a -70°C per 14 giorni. Come mostrato nella tabella 5, i risultati suggeriscono che gli analiti sono stabili nelle condizioni di cui sopra.

Composti Concentrazione Spiked (ng/mL) temperatura ambiente per 6 h tre cicli di congelamento-disgelo autocampionatore per 12 h -70°C per 14 giorni Concentrazione misurata (ng mL-1) RSD (%) Concentrazione misurata (ng mL-1) RSD (%) Misurato Concentrazione (ng mL-1) RSD (%) Concentrazione misurata (ng mL-1) RSD (%) rhein 1 0.97±0.02 2.0 0.98±0.03 2.8 0.97±0.01 0.8 0.95±0.05 5.4 10 10.23±0.04 0.4 8.89±0.08 0.9 9.86±0.09 0.9 8.71±0.11 1.3 100 101.97±1.07 1.1 86.7±1.33 1.5 97.32±1.05 1.1 85.95±0.39 0.5 emodina 2 1.95±0.05 2.3 2.00±0.02 0.9 1.93±0.02 0.8 1.86±0.03 1.6 20 21.14±0.99 4.7 19.21±0.33 1.7 19.88±1.81 9.1 18.79±0.18 0.9 200 207.49±1.27 0.6 197.74±5.65 2.9 200.50±11.66 5.8 185.45±0.98 0.5 glicoside stilbene 2 1.82±0.01 0.8 2.00±0.03 1.6 1.89±0.00 0.1 1.99±0.01 0.3 20 20.88±1.19 5.7 19.87±1.43 7.2 19.00±0.64 3.4 20.01±0.31 1.6 200 202.79±12.80 6.3 200.45±2.10 1.1 182.40±1.23 0.7 203.34±1.39 0.7 acido gallico 2 1.97±0.03 1.5 1.93±0.04 1.8 2.03±0.05 2.3 1.99±0.04 2.0 20 20.77±1.09 5.3 20.08±0.51 2.5 19.27±0.35 1.8 19.26±0.22 1.2 200 205.97±2.14 1.0 196.77±1.09 0.6 184.54±2.46 1.3 199.19±1.80 0.9 ononina 2 2.02±0.03 1.4 1.85±0.01 0.7 1.83±0.01 0.4 1.95±0.01 0.5 20 20.57±0.26 1.2 18.71±0.26 1.4 18.84±0.62 3.3 18.51±0.15 0.8 200 216.32±0.91 0.4 191.28±2.36 1.2 195.34±4.30 2.2 200,23±3,89 1,9 verbascoside 1 0,92±0.01 1.0 1.09±0.01 0.9 1.05±0.02 1.8 1.01±0.02 2.3 10 9.57±0.21 2.2 10.17±0.90 8.9 9.50±0.04 0.5 9.81±0.22 2.2 100 103.95±1.33 1.3 108.42±1.17 1.1 93.52±0.27 0,3 107,40±1,47 1,4 liquiritina 10 9.85±0.09 1.0 9.26±0.16 1.7 10.26±0.11 1.1 10.04±0.12 1.2 100 108.97±1.51 1.4 109.67±1.86 1.7 108.02±0.66 0.6 105.05±1.73 1.7 1000 1076.07±10.27 1.0 952.89±11.22 1.2 869.12±14.52 1.7 1021.69±19.98 2.0 schisandrin 2 2.00±0.04 1.8 1.71±0.01 0.6 1.83±0.02 1.1 1.77±0.03 1.7 20 21.15±0.50 2.4 18.28±0.23 1.2 18.35±0.09 0.5 17.86±0.20 1.1 200 194.61±1.13 0.6 189.32±1.74 0.9 196.02±2.10 1.1 183.83±1.00 0.6 liquiritigenina 1 0,87±0,01 0,9 0,89±0,02 1.8 0.87±0.01 1.1 0.88±0.02 2.1 10 10.82±0.58 5.3 8.99±0.07 0.8 8.63±0.23 2.7 9.26±0.08 0.9 100 112.69±1.30 1.2 92.59±0.63 0.7 92.65±0.68 0.7 91.88±0.86 0.9 acido glicirrizico 20 20,49±0,79 3,9 19.30±0.20 1.0 19.25±0.34 1.8 18.77±0.09 0.5 200 203.22±3.32 1.6 188.63±3.57 1.9 200.96±3.93 2.0 200.33±2.98 1.5 2000 2099.10±8.92 0.4 1869.00±42.55 2.3 1884.66±9.26 0.5 1834.54±29,34 1,6 isoliquiritigenina 1 0,99±0.01 1.5 0.89±0.02 2.4 1.00±0.02 1.7 0.89±0.01 1.4 10 10.86±0.60 5.5 8.69±0.14 1.6 9.60±0.04 0.4 8.62±0.04 0.4 100 106.11±0.78 0.7 100.58±0.91 0.9 97.47±1.99 2.0 100.74±2.95 2.9

Tabella 5

Stabilità di tutti gli analiti nel plasma di ratto (n=6).

3.4. Studio farmacocinetico

Il metodo LC-MS/MS convalidato è stato applicato allo studio farmacocinetico degli undici analiti nel campione di sangue di ratto dopo la somministrazione orale di TMYX ad una singola dose di 8,3 g/kg. I principali parametri farmacocinetici sono stati dimostrati nella tabella 6. E i profili medi di concentrazione-tempo nel plasma degli undici principi attivi sono stati mostrati nella Figura 3.

Composti Tmax1 (h) Tmax2 (h) Cmax1 (ng/mL) Cmax2 (ng/mL) t1/2 (h) Ke (1/h) (h-ng/mL) (h-ng/mL) rhein 0.36±0.31 46.3±15.6 2.84±2.13 0.56±0.50 145.0±52.6 152.1±61.3 emodina 0.32±0.14 88.0±37.5 4.21±2.63 0.39±0.28 475.5±121.0 561.3±192.3 glicoside stilbene 0.50±0.31 99.1±27.1 1.99±1.31 0.45±0.24 283.8±189.1 297.5±185.3 liquiritina 0.50±0.46 199.9±120.2 2.16±1.44 0.77±0.54 637.2±220.2 651.1±219.5 ononina 0,46±0,10 14,4±6,8 2.85±1,40 0,37±0,25 58,2±20,2 69,4±28,5 verbascoside 0.37±0.18 23.4±8.7 1.53±0.67 0,56±0,31 51,4±29,8 61,0±29,8 acido gallico 0.75±0.67 56.9±42.8 3.01±1.35 0.27±0.12 214,7±136,7 238,4±172,8 schisandrin 1,00±0.92 92.6±53.0 2.73±1.54 0.34±0.19 410.8±238.9 473.4±321.2 liquiritigenina 0.20±0.07 7.20±3.35 37.8±24.1 21.0±15.3 12.70±7.04 0.50±0.34 314,8±129,8 332,6±142,1 acido glicirrizico 2,13±1.44 17.67±10.31 351.7±347.4 476.1±146.0 18.19±9.61 0.05±0,03 12743,5±5058,2 17327,3±10967,3 isoliquiritigenina 0.28±0.11 7.00±2.45 41.6±24.2 24.9±13.5 13.46±8.33 0.07±0.04 410.0±130.7 436.2±154.1

Tabella 6

Parametri farmacocinetici di 11 analiti dopo somministrazione orale di estratto TMYX (n=6).

Figura 3

Curve concentrazione-tempo medie nel plasma di reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrin, liquiritigenina, acido glicirrizico e isoliquiritigenina dopo la somministrazione orale dell’estratto di TMYX (media ± SD, n=6).

Il Tmax di reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico e schisandrina sono 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h, e 1,00±0,92 h, rispettivamente. Il Tmax mostra che otto ingredienti sono assorbiti rapidamente. I doppi picchi sono rilevati nei profili di concentrazione-tempo medi del plasma per la liquiritigenina, l’acido glicirrizico e l’isoliquiritigenina. Il primo picco di tre ingredienti è apparso a 0,20 h, 2,13 h e 0,28 h e il secondo picco a 7,20 h, 17,67 h e 7,00 h, rispettivamente. Potrebbe risultare dalla circolazione epatoenterale. Un picco di concentrazione plasmatica di liquiritigenina, isoliquiritigenina e acido glicirrizico è stato riportato nel plasma di ratto dopo la somministrazione orale di Radix glycyrrhizae o la combinazione di Radix glycyrrhizae e Ramulus cinnamomi. Le differenze possono derivare dagli effetti di altre erbe in TMYX che richiedono ulteriori esperimenti. Oltre ai doppi picchi, l’emivita di eliminazione (t1 /2) di reina, emodina, acido gallico, glicirrizina, glicoside stilbene, verbascoside, formononetina e schisandrina varia da 1,53 h a 4,21 h, il che suggerisce che questi otto analiti nel campione di sangue di ratto sono eliminati rapidamente dopo la somministrazione orale. Il simile andamento farmacocinetico della schisandrina è stato riportato dopo la somministrazione orale dell’estratto acquoso di Fructus schisandrae. È stato anche riportato che un picco è stato osservato per l’emodina e l’acido gallico nel ratto dosato elaborato Radix polygoni multiflori . I t1 /2 della liquiritigenina, dell’acido glicirrizico e dell’isoliquiritigenina sono 12,70 h, 18,19 h e 13.46 h, il che indica che l’ingrediente ha un tempo di trattamento più lungo, specialmente l’isoliquiritigenina e l’acido glicirrizico, che possono ancora essere rilevati in vivo a 48 h.

4. Conclusione

Nel nostro esperimento, abbiamo sviluppato un metodo di HPLC-MS/MS per rilevare la reina, emodina, glicoside stilbene, liquiritina, ononina, verbascoside, acido gallico, schisandrin, liquiritigenina, acido glicirrizico e isoliquiritigenina nel plasma di ratto. I parametri farmacocinetici sarebbero utili per l’ulteriore sviluppo e utilizzo in clinica di TMYX. Gli 11 principi attivi di TMYX, che sono stati assorbiti nel plasma, fornirebbero dati di supporto per il miglioramento del controllo di qualità.

Data Availability

I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81673824 e 81503457) e Tianjin Municipal Education Commission Research Project (2017KJ139).