Badani i procedury obrazowania
Eksperyment 1 (3,0 T): Dwadzieścia zdrowych dorosłych osób (11 mężczyzn, wiek 26,2 ± 3,1 lat) wyraziło świadomą zgodę na udział w eksperymencie. Dane 16 uczestników zostały już przedstawione w naszym poprzednim badaniu15. Czterech uczestników zostało nowo zrekrutowanych do tego badania. Kryteria wykluczenia obejmowały istotną historię psychiatryczną lub neurologiczną. Badanie zostało zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Naukowych (REB) Uniwersytetu w Toronto i REB szpitala SickKids. Nie przeprowadzono żadnego testu statystycznego w celu określenia wielkości próby a priori. Wybrane przez nas wielkości prób są podobne do tych stosowanych w poprzednich publikacjach16, 26. Eksperyment przeprowadzono przy użyciu systemu 3.0 T fMRI (Siemens Trio). Obrazy lokalizatora zostały najpierw zebrane w celu wyrównania pola widzenia (FOV) wyśrodkowanego na mózgu każdego uczestnika. Przed eksperymentalnym obrazowaniem echo-planarnym (EPI) uzyskano obrazy anatomiczne T1-ważone (1 mm3, 256 × 256 FOV; sekwencja MPRAGE). Do obrazowania czynnościowego zastosowano gradientową sekwencję echo-planarną (czas repetycji (TR) = 2000 ms; czas echa (TE) = 27 ms; kąt flipcji = 70°). Każdy przebieg czynnościowy składał się z 263 akwizycji całego mózgu (plasterki 40 × 3,5 mm; akwizycja interleaved; FOV = 192 mm; rozmiar matrycy = 64 × 64; rozdzielczość w płaszczyźnie 3 mm). Pierwsze cztery funkcjonalne obrazy w każdym przebiegu zostały wyłączone z analizy, aby umożliwić wyrównanie magnetyzacji podłużnej.
Doświadczenie 2 (7,0 T): Jedenaście zdrowych dorosłych osób (6 mężczyzn, wiek 22,2 ± 2,2 lat) wyraziło świadomą zgodę na udział w eksperymencie. Badanie to zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Narodowego Instytutu Nauk Fizjologicznych w Japonii. Nie przeprowadzono żadnego testu statystycznego w celu określenia wielkości próby a priori. Wybrane przez nas wielkości próbek są podobne do tych stosowanych w poprzednich publikacjach16, 26. Eksperyment przeprowadzono przy użyciu systemu 7.0 T fMRI (Siemens Magnetom). Obrazy lokalizatora zostały najpierw zebrane w celu wyrównania FOV wyśrodkowanego na mózgu każdego uczestnika. Uzyskano obrazy anatomiczne T1 (izometryczne 0,75 mm, 224 × 300 FOV; sekwencja MPRAGE). Do obrazowania czynnościowego zastosowano gradientową sekwencję echo-planarną (TR = 500 ms; TE = 25 ms; kąt flipcji = 35°; współczynnik wielopasmowy = 4). Każdy przebieg funkcjonalny składał się z 1010 akwizycji całego mózgu (32 × 2,0 mm plasterki; akwizycja interleaved; FOV = 208 mm; rozmiar matrycy = 104 × 104; rozdzielczość w płaszczyźnie 2 mm). Pierwsze cztery funkcjonalne obrazy w każdym przebiegu zostały wyłączone z analizy, aby umożliwić wyrównanie namagnesowania podłużnego.
Procedury behawioralne
Doświadczenie 1: Bodźce smakowe były dostarczane przez plastikowe rurki zbiegające się w plastikowym kolektorze, którego dysza kapała roztwory smakowe do ust. Rurki były wstępnie napełnione, tak że nie obserwowano prawie żadnego opóźnienia pomiędzy prezentacją bodźca wzrokowego a podaniem płynu. Sto prób podawania roztworu smakowego było randomizowanych i zrównoważonych w pięciu seriach. W każdej próbie, 0,5 mL roztworu smakowego dostarczane było w czasie 1244 ms. Po zakończeniu podawania płynu, na ekranie pojawiała się informacja o konieczności połknięcia go (1 s). Po 7756 ms, pojawiały się paski skalujące, które oceniały pozytywność (3 s), a następnie negatywność (3 s) płynu. Następnie w ciągu 1244 ms podawano 0,5 mL bezsmakowego płynu do płukania, po czym następowała instrukcja połykania przez 1 s. Po przerwie między próbami wynoszącej 7756 ms, rozpoczynała się kolejna próba.
Doświadczenie 2: W porównaniu z Doświadczeniem 1, dostarczanie bodźców smakowych różniło się jedynie czasem i ilością. Sto prób z roztworem smakowym było randomizowanych i zrównoważonych w pięciu seriach. W każdej próbie podawano 0,88 mL roztworu smakowego w czasie 2 s. Po zakończeniu podawania płynu, na ekranie pojawiała się informacja o konieczności połknięcia go (2 s). Po 4000 ms, pojawiały się paski skalujące, które oceniały pozytywność (3 s), a następnie negatywność (3 s) płynu. Następnie w ciągu 2 s podawano 0,88 mL bezsmakowego płynu do przepłukania, po czym następowała instrukcja połykania przez 2 s. Po 7 s przerwy pomiędzy próbami, rozpoczynała się kolejna próba.
Sesja przedeksperymentalna
Doświadczenie 1: Aby uwzględnić indywidualne różnice w subiektywnym doświadczeniu różnych smaków, uczestnicy zostali poproszeni o spróbowanie szerszego zakresu intensywności (mierzonej stężeniem molowym) różnych roztworów smakowych (kwaśnego, słonego, gorzkiego i słodkiego). Podczas sesji przedeksperymentalnej, uczestnicy byli testowani przez 1 próbę (2 ml) każdego z 16 roztworów smakowych w następujący sposób: (1) kwaśny/kwas cytrynowy: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M oraz 1,0 × 10-2 M; (2) słony/sól kuchenna: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M, oraz 1,0 × 10-1 M; (3) gorzki/siarczan chininy: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M, oraz 7,8 × 10-6 M; oraz (4) słodki/sacharoza: 1,0 M, 0,56 M, 0,32 M i 0,18 M. Kolejność prezentacji była randomizowana według smaku, a następnie według stężenia w obrębie każdego smaku. Po wypiciu każdego z roztworów, uczestnicy wypłukiwali i połykali 5 mL wody, a następnie oceniali intensywność i przyjemność (walencję) doznań płynących z wypicia roztworu na oddzielnych skalach od 1 do 9. Dla każdego smaku wybrano stężenie, które pasowało do siebie pod względem intensywności. Wcześniejsze prace2 wykazały, że uczestnicy mają różne punkty odniesienia w ocenie doznań smakowych, a stężenia wybierane w sposób najbardziej wiarygodny są powyżej średniej intensywności odczuwanej przez nich samych. Wszystkie roztwory zostały zmieszane przy użyciu farmaceutycznej klasy związków chemicznych firmy Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), bezpiecznych do spożycia.
Doświadczenie 2: Uczestnicy byli testowani przez 1 próbę (1 mL) każdego z 16 roztworów smakowych w następujący sposób: (1) słodki 1/glukoza: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M, i 0,38 M; (2) słodki 2/sukraloza: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M, i 0,26 × 10-4 M; (3) gorzki 1/katechina: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M, i 4,4 × 10-3 M; i (4) gorzki 2/chlorek magnezu: 0,4 M, 0,2 M, 0,1 M i 0,05 M. Kolejność prezentacji była randomizowana według smaku, a następnie według stężenia w obrębie każdego smaku. Po wypiciu każdego z roztworów, uczestnicy wypłukiwali i połykali 5 mL wody, a następnie oceniali intensywność i przyjemność (walencję) doznań płynących z wypicia roztworu na oddzielnych skalach od 1 do 9. Dla każdego smaku wybrano stężenie, które pasowało do siebie pod względem intensywności. Wszystkie roztwory mieszano przy użyciu związków chemicznych klasy spożywczej, pochodzących z firm DHC (katenchina), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (chlorek magnezu), Tsuruya Chemical Industries (sukraloza) i Nichiga (glukoza).
Analiza danych
Dane analizowano przy użyciu oprogramowania SPM8 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Obrazy funkcjonalne zostały wyrównane, skorygowane pod względem czasu wycinka i znormalizowane do szablonu MNI (ICBM 152) z interpolacją do przestrzeni 2 × 2 × 2 mm. Dane zostały przestrzennie wygładzone (pełna szerokość, połowa maksimum (FWHM) = 6 mm) dla jednoczynnikowej analizy parametrycznej modulacji, ale nie dla analizy wzorca wieloobszarowego, ponieważ może to pogorszyć wydajność19. Każda prezentacja bodźca była modelowana jako osobne zdarzenie, przy użyciu funkcji kanonicznej w SPM8. Dla każdego woksela wartości t dla poszczególnych prób zostały zdegradowane przez odjęcie średniej wartości dla wszystkich prób. Do wizualizacji wyników obrazowania użyto oprogramowania freesurfer39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) i SPM surfrend toolbox (napisany przez I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net) po modyfikacji.
Analiza jednoczynnikowa
Przeprowadziliśmy analizę jednoczynnikową, aby zbadać, czy podstawowe smaki były kodowane przez specyficzne woksele w insuli. Regresory kodujące każdy smak były powiązane czasowo z prezentacją bodźca. Analizy jednoczynnikowe przeprowadzono dwukrotnie: z i bez regresorów walencji hedonicznej (Ryc. 1). Aby zobrazować, jak wiele wariancji może być wyjaśnione przez hedoniczne regresory walencji w regionach wrażliwych na gorycz, wybraliśmy znaczące woksele w kontraście „gorzki vs. bez smaku” bez regresji walencji (Rycina 1). Uśredniona aktywność została przedstawiona dla aktywności względem spoczynkowej linii podstawowej (Supplementary Figure 1a), aktywności względem bezsmakowej (Supplementary Figure 1b) i aktywności względem bezsmakowej z pominięciem regresji walencji (Supplementary Figure 1c). Aby sprawdzić istnienie specyficznego dla wokseli dostrajania się do smaku, rozdzieliliśmy nieparzyste i parzyste przebiegi każdego uczestnika, porównując aktywność wokseli dla każdego smaku w nieparzystych przebiegach z aktywnością wokseli dla każdego smaku w przebiegach parzystych. Dla ilustracji, gdy woksele zostały uporządkowane według aktywacji dla każdego smaku w biegach parzystych, znaleźliśmy spójne wzorce odpowiednio malejącej aktywacji dla wszystkich czterech smaków w biegach nieparzystych (ryc. 1b, rycina uzupełniająca 4). Obliczono korelacje pomiędzy aktywacją w wokselach pomiędzy przebiegiem nieparzystym i parzystym dla wszystkich kombinacji smaków w obrębie każdego uczestnika, poddając je jednopróbkowemu testowi t dla wszystkich uczestników (Ryc. 1c, Ryc. 4a, b). Następnie obliczyliśmy korelacje pomiędzy nieparzystymi i parzystymi przebiegami dla wszystkich kombinacji tego samego smaku i różnych smaków w obrębie każdego uczestnika. Współczynniki korelacji zostały z-transformowane i poddane jednopróbkowemu testowi t między uczestnikami (Ryc. 1d, Ryc. 4b, d).
Analiza światła poszukiwawczego dla reprezentacji typu smakowego
Przeanalizowaliśmy dane fMRI kory wyspowej używając analizy światła poszukiwawczego (promień 4 mm, obejmujący 33 woksele)20. W obrębie danej sfery dla każdego uczestnika utworzono wektor zawierający przestrzenny wzorzec sygnału BOLD-MRI powiązany czasowo z prezentacją bodźca (znormalizowane wartości t na woksel). Aby ocenić, czy wzorce aktywności w sferach reflektorów są zdolne do dyskryminacji smaku, zastosowaliśmy walidację krzyżową typu leave-one-stimulus-pair-out40. W tej procedurze, klasyfikator LDA był trenowany na 38 próbach, które zawierały testowany rodzaj smaku i inny rodzaj smaku (19 prób dla każdego), a następnie testowany na pozostawionej parze bodźców. Wyniki klasyfikacji dla każdego smaku były uśredniane dla porównań z innymi smakami (np. wyniki klasyfikacji smaku kwaśnego były uśredniane dla smaków kwaśnego i słodkiego, kwaśnego i gorzkiego, kwaśnego i słonego oraz kwaśnego i bezsmakowego). Na poziomie indywidualnym, 58,7% dokładności klasyfikacji odpowiadało p < 0,05 bez korekty. Do analizy grupowej, indywidualne mapy wydajności klasyfikacji zostały wygładzone za pomocą jądra gaussowskiego o szerokości 4 mm FWHM, a następnie poddane jednopróbkowemu testowi permutacji przy użyciu SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). W tej procedurze dane od każdego uczestnika były losowo odwracane przez pomnożenie – 1 po odjęciu 50% (dokładność na poziomie szansy), a następnie poddane jednopróbkowemu testowi t dla wszystkich uczestników. W ten sposób uzyskano rozkład maksymalnego t w obrębie insuli, który był permutowany 10 000 razy. Na podstawie tego rozkładu wyznaczono próg 5% FWE.
Analiza koniunkcji smaków
Dla analizy koniunkcji wielu smaków (ryc. 2b), każdy woksel był testowany pod kątem tego, czy przekroczył próg dla czterech dyskryminacji typu smaku, gdzie każda dyskryminacja typu smaku uśrednia wyniki klasyfikacji dla czterech porównań (np. kwaśny vs. słodki, kwaśny vs. gorzki, kwaśny vs. słony i kwaśny vs. bez smaku), przekraczając klasyfikację przypadkową (50%). Poprawne wnioskowanie koniunkcyjne wymaga istotnych wyników dla wszystkich porównań41. Policzyliśmy zatem liczbę rodzajów smaku spełniających 5% próg FWE w każdym wokselu w obrębie wyspy.
Analiza par smakowych
Do analizy konkretnych par smakowych, zbadaliśmy niezależnie zdefiniowane ROI w obrębie wyspy. Najpierw zastosowaliśmy procedurę leave-one-subject-out, wykluczając każdego z 20 badanych, a następnie obliczając mapę koniunkcji 4 smaków (tj. wokseli spełniających wszystkie 4 kontrasty smakowe opisane powyżej) z pozostałymi 19 badanymi, co dało 20 map. Nakładanie się tych 20 map grupowych pokazano na ryc. 2c. Woksele z mapy spełniającej 5% próg FWE zostały zdefiniowane jako ROI zdolne do dyskryminacji smaku. W obrębie tego ROI badano dyskryminację określonych par smaków, obliczając wyniki klasyfikacji dla każdej pary smaków. Wyniki grupowe zostały obliczone jako średnia wyników klasyfikacji dla 20 badanych (ryc. 2d).
Dla dyskryminacji par smaków na podstawie oceny walencji (ryc. 2e), przeprowadziliśmy analizę LDA używając ocen walencji dokonanych przez badanych (tj. niezależnych od danych z fMRI). Wartość walencji obliczano przez odjęcie oceny negatywności od oceny pozytywności dla każdej próby. Klasyfikacja smaku została obliczona przy użyciu metody leave-one-trial-out, wytrenowanej na 19 pozostałych próbach dla każdego typu smaku.
Analiza walencji i typu smaku
Aby sprawdzić niezależność typu smaku od walencji, zbadaliśmy podobieństwo danych fMRI w obrębie ROI zdefiniowanego przez powyższą mapę koniunkcji czterech smaków. Dla każdego uczestnika obliczono korelacje trial-by-trial, uzyskując 4950 (100 × 99/2) współczynników korelacji, uporządkowanych w 2 × 2 kategorie typu smaku (taki sam, inny) × walencja hedoniczna (taka sama, inna). Współczynniki korelacji zostały uśrednione w obrębie każdej komórki dla każdego badanego, a następnie dane wszystkich badanych zostały poddane dwukierunkowej ANOVA z typem smaku i walencją jako czynnikami (ryc. 2g).
Przeprowadziliśmy dalszą analizę bez zależności danych w korelacjach trial-by-trial w obrębie komórek 2 × 2. Losowo zaludniliśmy każdą komórkę 100 próbami, powtarzając tę procedurę 1 000 000 razy. Spośród nich przeanalizowaliśmy permutację z największą zgodnością między czynnikami 2 × 2 a rzeczywistymi kategoriami prób (w oparciu o maksymalną średnią geometryczną proporcji zredukowanych danych w czterech komórkach). Następnie obliczyliśmy korelacje między próbami tylko w obrębie każdej komórki, zapewniając brak zależności między komórkami. Współczynniki korelacji zostały uśrednione w obrębie każdej komórki dla danego osobnika, a następnie dane wszystkich pozostałych osobników poddano dwukierunkowej ANOVA (Supplementary Figure 3).
Wzorce typów smakowych różniły się niezależnie od walencji smakowej, tzn. mapy dyskryminacji smakowej były rozłączne od smakowitości. Ze względu na silny związek pomiędzy typem smaku a walencją, kombinacje prób nie były jednakowe na wszystkich poziomach. Na przykład, ta sama walencja przy różnych typach smaku występowała stosunkowo rzadko (Tabela 4). Nie wskazuje to jednak na wieloliniowość w wielkości efektu.
Statystyki
Przeanalizowaliśmy dane bez zakładania rozkładu normalnego, używając statystyk nieparametrycznych. Przed ANOVA (ryc. 2g) przeprowadzono test Levene’a, aby upewnić się, że spełnione jest założenie homoscedastyczności. Zastosowano korekty wielokrotnych porównań, wykorzystując korektę Bonferroniego.
Podsumowanie
Dalsze informacje na temat projektu eksperymentalnego są dostępne w podsumowaniu Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.
.
