Development of a HPLC-MS/MS Method to Determine 11 Bioactive Compounds in Tongmai Yangxin Pill and Application to a Pharmacokinetic Study in Rats

Abstract

A sensitive and reliable HPLC-MS/MS method has been developed and validated for simultaneous determination of unsprezece compuși bioactivi (rhein, emodin, glicozidul stilbene, liquiritin, ononin, verbascoside, acidul galic, schisandrin, liquiritigenin, acidul glicirizic și isoliquiritigenin) în plasma de șobolan după administrarea orală a pastilei Tongmai Yangxin. Probele de plasmă colectate au fost pregătite prin extracție lichid-lichid cu acetat de etil după acidificare. Unsprezece compuși au fost separați pe o coloană CORTECS™ C18 cu faze mobile formate din acid formic 0,1% în apă deionizată și acetonitril. Debitul a fost de 0,3 ml/min. Detecția a fost efectuată pe un sistem de masă în tandem cu o sursă de ionizare prin electrospray (ESI) atât în ionizare pozitivă, cât și negativă, utilizând modul de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM). Curbele de calibrare au fost liniare pe un interval de 8-2000 ng/mL pentru acidul glicirizic; 4-1000 ng/mL pentru liquiritină; 0,8-200 ng/mL pentru emodin, acid galic, ononin, schisandrin și glicozidul stilbenic; 0,4-100 ng/mL pentru isoliquiritigenină, liquiritigenină, reină și, respectiv, verbascosidă. Precizia intraday și interday a analiților a fost mai mică de 9,3 % și 8,5 %. Precizia intra- și interjurnală a fost cuprinsă între -14,0% și 10,3% și între -6,5% și 9,6%. Între timp, recuperarea prin extracție a analiților în probele de plasmă a variat de la 85,2 % la 109,1 %, iar efectul de matrice de la 89,2 % la 113,4 %. Metoda dezvoltată a fost aplicată cu succes la farmacocinetica a unsprezece compuși bioactivi în plasma de șobolan după administrarea orală a rețetei Tongmai Yangxin Pill.

1. Introducere

Medicina tradițională chineză (TCM) este o comoară prețioasă a naturii. MTC sunt utilizate în clinică de mii de ani și atrag o atenție din ce în ce mai mare datorită tratamentului diverselor boli cu succes și cu efecte secundare minime . Prescripția MTC, forma cea mai frecvent utilizată în medicația clinică, are multicomponente și obiective multiple. Componentele multiple și țintele multiple reprezintă superioritatea și caracteristica acțiunilor farmacologice ale MTC .

Pilula Tongmai Yangxin (TMYX) este un medicament tradițional chinezesc brevetat, documentat în farmacopeea chineză. Rețeta a fost elaborată pornind de la o binecunoscută pereche de plante „GuiZhi-GanCao” documentată în „Shang-Han-Lun” de Zhongjing Zhang în timpul dinastiei Han de Est. Rețeta este alcătuită din unsprezece plante, inclusiv Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis și Fructus jujubae . TMYX a fost utilizat pentru tratarea bolilor coronariene, a aritmiei, a durerilor toracice și a anginei pectorale timp de mai multe decenii . Studiile farmacologice moderne arată că TMYX are un efect semnificativ asupra bolilor de inimă. S-a constatat că patru compuși flavonoizi activi (glyasperin A, glycycoumarin, licorisoflavan A și licoisoflavone A) din TMYX au o activitate biologică satisfăcătoare și promovează proliferarea și angiogeneza celulelor endoteliale ale venei ombilicale umane la peștele zebră . Între timp, Liu et al. au raportat că s-a constatat că cinci fracțiuni din TMYX exercită o activitate de tranziție antiepitelială-mesenchimală . Rezultatele lui Tao au indicat că șase ingrediente active cu valori R ridicate (gomisina D, schisandrina, acidul glicirizic, glicozidul stilbenei, formononetina și ononina) exercită efecte antiinflamatorii într-o manieră dependentă de doză.

Efectele farmacologice ale TMYX se bazează pe compoziția chimică diversă. Chen a raportat că 80 de compuși au fost identificați sau presupuși cu ajutorul HPLC-MS, inclusiv 23 de flavone și glucuronidele lor, 6 glicozide de alcool fenetilic, 20 de saponine triterpenice, 15 lignani și 18 alți compuși . Fan a caracterizat 40 de componente bioactive absorbite după administrarea orală de TMYX în serul de șobolan prin UPLC/Q-TOF-MS . Cele 40 de componente includ 2 din Radix rehmanniae, 10 din Radix codonopsis, 2 din Radix ophiopogonis, 2 din Ramulus cinnamomi, 19 din Radix glycyrrhizae, 2 din Radix polygoni multiflori preparata, 5 din Caulis spatholobi, 1 din Fructus jujubae și 1 din Fructus schisandrae, dintre care unele se suprapun. Majoritatea ingredientelor exercită efecte antiinflamatorii și antioxidante, exercitând, în plus, efectul de protecție cardiovasculară. Echipa determină, de asemenea, concentrațiile de liquiritină, liquiritigenină, izoliquiritigenină, acid glicirrizic și acid glicirretinic în plasma de șobolan în urma administrării orale de Radix glycyrrhizae sau a combinației de Radix glycyrrhizae și Ramulus cinnamomi prin HPLC-UV. Cu toate acestea, nu există nicio publicație care să raporteze studiul farmacocinetic al TMYX.

Farmacocinetica (PK) a TCM-urilor este o ramură a farmacologiei TCM-urilor. PK a TCM-urilor se concentrează pe studierea cantitativă a legilor de absorbție, distribuție, metabolizare și excreție a medicamentelor într-un organism viu. Studiul PK al multicomponentelor din rețetele de MTC a fost unul dintre aspectele de cercetare importante ale modernizării MTC . Datele PK ar putea elucida baza de substanță și ar putea dezvălui conotația științifică a TCM-urilor. De asemenea, joacă un rol important în crearea de noi medicamente chinezești, îmbunătățirea formelor de dozare și a mecanismului de formulare. În studiul de față, a fost dezvoltată pentru prima dată o metodă HPLC-MS/MS fiabilă și sensibilă și a fost aplicată la studiul farmacocinetic a 11 componente bioactive, inclusiv reina, emodina, glicozidul stilbene, lichiritina, ononina, verbascosida, acidul galic, schisandrina, lichiritina, acidul glicirizic și izoliquiritigenina la șobolani după administrarea orală de TMYX. Au fost puse în evidență caracteristicile farmacocinetice ale principalelor componente chimice ale TMYX la șobolani, ceea ce ar oferi o bază teoretică pentru utilizarea TMYX în clinică.

2. Experimental

2.1. Substanțe chimice, reactivi și materiale

Metanolul (puritate cromatografică) și acetonitrilul (puritate cromatografică) au fost achiziționate de la Merck Co., Ltd. Acidul formic (puritate cromatografică) a fost obținut de la ROE Co., Ltd. Apa ultrapură a fost preparată cu un sistem de purificare a apei Milli-Q (Millipore, Milford, MA, SUA). Rhein, emodin, glicozidul stilbene, liquiritin, ononin, verbascoside, acidul galic, schisandrin, liquiritigenin, acidul glicirrizic, isoliquiritigenin și icariin au fost achiziționate de la Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). TMYX au fost furnizate de Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Condiții cromatografice și de spectrometrie de masă

Sistemul HPLC-MS/MS este format dintr-un cromatograf lichid de înaltă performanță Agilent 1200 cuplat cu un spectrometru de masă triplu cvadrupol Aglient 6430 series cu o sursă de ionizare prin electrospray (ESI). Separarea cromatografică a fost realizată pe o coloană CORTECS C18 (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), iar temperatura coloanei a fost menținută la 30°C. Fazele mobile care au constat din acid formic 0,1% în apă (A) și acetonitril (B) au fost utilizate în următoarea metodă de eluție în gradient: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. Debitul a fost setat la 0,3 ml/min, iar volumul de injecție a fost de 10 μL. Toate datele au fost analizate cu software-ul stației de lucru Mass Hunter (Agilent Technologies, SUA).

Spectrometrul de masă a fost efectuat atât în modul de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM) cu ionizare pozitivă, cât și negativă. Parametrii sursei au fost următorii: tensiunea capilară setată la 300 V pentru modul de ionizare pozitivă și la -300 V pentru modul de ionizare negativă, temperatura gazului de uscare a fost de 320°C, debitul a fost de 11 L/min, iar presiunea gazului de nebulizare a fost de 30 psi. Precursorul și producția ingredientelor și parametrii MRM au fost afișați în tabelul 1.

2.3. Prepararea extractului TMYX

Extractul TMYX a fost preparat după cum urmează: Un total de 100 g de pulbere TMYX a fost cântărit cu exactitate și extras de două ori sub reflux termic cu cantități de patru ori mai mari de etanol 60% (v/v) timp de 1 h de fiecare dată. După aceea, soluțiile de extracție au fost filtrate și amestecate. Soluția amestecată a fost concentrată prin evaporare sub presiune redusă. Apoi, extractele uscate au fost zdrobite în pulbere și păstrate într-un desicator până la analiză. Extractele conțin reină, emodină, glicozidă stilbenică, lichiritină, ononină, verbascosidă, acid galic, schisandrin, lichiritigenină, acid glicirrizic și izoliquiritigenină 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 și, respectiv, 9,6 μg/g. Structurile compușilor din studiu au fost prezentate în figura 1.

Figura 1

Structurile chimice ale celor unsprezece componente.

2.4. Pregătirea soluțiilor de calibrare și a probelor de control al calității

Pentru a realiza soluția stoc, reina, emodina, glicozidul stilbenic, lichiritina, ononina, verbascosida, acidul galic, schisandrina, lichiritina, acidul glicirizic, izoliquiritigenina și icariina (soluție standard internă) au fost cântărite separat și diluate cu metanol până la o concentrație finală de 1 mg/mL. Soluția standard mixtă a fost obținută prin amestecarea unui volum corespunzător din unsprezece soluții stoc și diluarea cu metanol.

Soluțiile de calibrare au fost preparate prin adăugarea a 20 μL din soluția standard mixtă și 20 μL de SI în 100 μL de plasmă de șobolan martor. Concentrațiile finale ale analiților din serie au fost în intervalul de 8-2000 ng/mL pentru acidul glicirizic; 4-1000 ng/mL pentru liquiritină; 0,8-200 ng/mL pentru emodin, acid galic, ononin, schisandrin și glicozidul stilbene; și 0,4-100 ng/mL pentru isoliquiritigenină, liquiritigenină, reină și verbascosid.

Eșantioanele de control al calității (QC) la trei concentrații (concentrație scăzută, medie și ridicată) au fost alcătuite din soluții standard amestecate corespunzătoare cu proba de sânge albă ca soluții de calibrare pentru a îndeplini concentrațiile necesare. Toate soluțiile au fost păstrate la 4°C.

2.5. Pregătirea probei de plasmă

Plasma (100 μL) a fost îmbogățită cu 20 μL de metanol, 20 μL de SI (icariină, 1 μg/mL) și 20 μL de acid formic și apoi a fost amestecată în vortex. Amestecul a fost extras cu 800 μL de acetat de etil prin amestecare în vortex timp de 5 minute la temperatura camerei. După centrifugare la 14 000 rpm timp de 10 min, supernatantul a fost colectat într-un tub curat și evaporat până la uscare sub un curent de azot. Reziduul a fost reconstituit în 50 μL de metanol 50%, amestecat în vortex timp de 5 minute și centrifugat la 14.000 rpm timp de 10 minute. În cele din urmă, 10 μL de supernatant au fost injectați în sistemul LC-MS/MS pentru analiză.

2.6. Validarea metodei

2.6.1. Specificitate

Specificitatea a fost evaluată prin analizarea probelor de sânge blanc de la șase șobolani diferiți. Fiecare probă de plasmă a fost evaluată pentru interferențe endogene utilizând programul de extracție sugerat și condițiile LC-MS/MS de mai sus.

2.6.2. Linearitatea și LLOQ

Liniaritatea a fost obținută prin analizarea plasmei de șobolan martor cu o seriozitate de soluție standard mixtă și IS în duplicat pe parcursul a 3 zile consecutive. Curbele de calibrare au fost reprezentate grafic prin raporturile vârfurilor de suprafață (y) ale analitului față de standardul intern față de concentrația nominală (x). Factorul de ponderare este 1/x. Limita inferioară de cuantificare (LLOQ) a fost evaluată în funcție de zgomotul liniei de bază, definind un raport semnal/zgomot de aproximativ 10.

2.6.3. Precizia și acuratețea

Precizia și acuratețea au fost evaluate prin determinarea probelor QC la niveluri de concentrație scăzute, medii și ridicate (20, 200 și 2000 ng/mL pentru acidul glicirizic; 10, 100 și 1000 ng/mL pentru liquiritin; 2, 20 și 200 ng/mL pentru emodin, acid galic, ononin, schisandrin și glicozidul stilbenic; 1, 10 și 100 ng/mL pentru isoliquiritigenin, liquiritigenin, rhein și verbascoside). Toate nivelurile de concentrație au fost măsurate în șase repetiții. Precizia și acuratețea au fost testate o dată pe zi și repetate timp de 3 zile consecutive cu curba de calibrare standard. Precizia intraday și interday a fost definită ca abatere standard relativă (RSD), în timp ce acuratețea a fost determinată de eroarea relativă (RE %).

2.6.4. Recuperarea prin extracție și efectul de matrice

Recuperarea prin extracție a unsprezece analiți la trei niveluri de concentrație și IS au fost analizate prin compararea ariilor vârfurilor obținute din probele extrase cu cele ale probelor postextractate. Efectul de matrice al probelor și IS au fost estimate prin rapoartele ariilor de vârf ale analiților din probele îmbogățite postextracte față de cele obținute din probele neextracte. Atât recuperarea prin extracție, cât și efectul de matrice au fost testate în șase paralele.

2.6.5. Stabilitatea

Stabilitatea analiților din probele de plasmă a fost determinată prin analiza probelor QC de trei niveluri de concentrație în condiții diferite: depozitate la autosampler timp de 12 h, la temperatura camerei timp de 6 h, supuse la trei cicluri de îngheț-dezgheț și depozitate la -70°C timp de 14 zile. Toate studiile de stabilitate au fost măsurate în șase repetiții.

2.7. Studiu farmacocinetic

Șobolani Sprague-Dawley masculi (230-250 g) au fost obținuți de la Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd. Șobolanii au fost menținuți în condiții de mediu de control și au postit timp de 12 h cu acces liber la apă înainte de experimente. Extractele TMYX au fost dizolvate în CMC-Na și administrate pe cale orală șobolanilor la 8,3 g/kg. Probele de sânge (200 μl) au fost colectate din vena fossa orbitalis a șobolanilor la 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 și 48 h după administrarea orală în tuburi heparinizate. Și apoi probele de sânge au fost centrifugate la 7.000 rpm timp de 10 min pentru a obține imediat proba de plasmă. În cele din urmă, plasma obținută a fost depozitată la -70°C până la analiză. Parametrii farmacocinetici au fost calculați cu ajutorul programului informatic „Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Colegiul Medical din Wannan, China).

3. Rezultate și discuții

3.1. Metoda HPLC-MS/MS

Au fost testate mai multe faze mobile. În comparație cu un sistem de fază mobilă de gradient cu acetonitril-apă sau metanol-apă, faza mobilă conține 0,1% acid formic în apă ar putea îmbunătăți forma vârfului și crește răspunsul la semnal al analiților. Astfel, am ales apa care conține 0,1% acid formic ca fază mobilă.

Soluțiile standard de analiți și, respectiv, standardul intern au fost injectate în spectrometrul de masă. Ononina și schisandrina au fost testate în modul ionilor pozitivi, iar celelalte în modul negativ. Tranzițiile optimizate de la precursor la produs au fost monitorizate la 238,9→211,0 pentru reină, 269,0→225,0 pentru emodin, 405,2→242,8 pentru glicozidul stilbenic, 417,1→255,0 pentru lichiritină, 431,2→269,1 pentru ononină, 623.0→161,1 pentru verbascoside, 169,0→125,1 pentru acidul galic, 433,3→384,2 pentru schisandrin, 255,3→119,1 pentru liquiritigenin, 821,1→350,5 pentru acidul glicirizic, 255,1→118,9 pentru isoliquiritigenin și 721,0→513,2 pentru IS. Toate datele au fost prezentate în tabelul 1.

3.2. Pregătirea probei

În cadrul experimentului, am testat două metode de eliminare a probei de plasmă, inclusiv extracția lichid-lichid (LLE) și precipitarea proteinelor (PPT). Rezultatele arată că atât recuperarea, cât și efectele de matrice ale metodelor îndeplinesc cerințele pentru determinarea probelor biologice, iar substanțele endogene nu interferează cu analiza. Cu toate acestea, metoda PPT a prezentat o eficiență de extracție mai scăzută și un efect de matrice relativ mai mare. În consecință, am selectat extracția lichid-lichid (LLE) cu acetat de etil pentru a pregăti proba.

3.3. Validarea metodei

3.3.1. Specificitatea

Specificitatea a fost estimată prin compararea cromatogramelor probelor de sânge blanc de la șase șobolani diferiți cu probe de sânge care conțin analiți. Au fost accesate cromatogramele reprezentative ale probei de sânge martor, ale probei de sânge martor care conținea unsprezece analiți și IS și ale probei de plasmă obținute de la un șobolan după administrarea orală de extracte de TMYX. Timpul de retenție al reinei, emodinei, glicozidului stilbenic, liquiritinei, ononinei, verbascosidei, acidului galic, schisandrinei, liquiritigeninei, acidului glicirrizic, isoliquiritigeninei și IS a fost de 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 și, respectiv, 12,19 min. Pe baza cromatogramelor, substanțele endogene din probele de plasmă nu interferează cu determinarea analiților și a SI. Cromatogramele au fost prezentate în figura 2.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figura 2

Cromatograme RMM a unsprezece analiți. rhein (1), emodin (2), glicozidul stilbene (3), acidul glicirizic (4), liquiritin (5), liquiritigenin (6), isoliquiritigenin (7), ononin (8), verbascoside (9), acidul galic (10), schisandrin (11) și IS (12). (a) plasmă albă; (b) plasmă albă îmbogățită cu analiți și IS; (c) probă de plasmă după administrarea orală a extractului de TMYX.

3.3.2. Linearitate și sensibilitate

Rezultatele curbelor de calibrare, ale intervalelor liniare, ale coeficienților de corelație și ale LLOQ-urilor au fost afișate în tabelul 2. Curbele de calibrare a plasmei au fost construite în intervalul de 8-2000 ng/mL pentru acidul glicirizic; 4-1000 ng/mL pentru liquiritină; 0,8-200 ng/mL pentru emodin, acid galic, ononin, schisandrin și glicozidul stilbenic; 0,4-100 ng/mL pentru isoliquiritigenină, liquiritigenină, reină și verbascosid.

LLOQ-urile pentru 11 analiți din proba de plasmă au fost mai mici de 8 ng/mL, ceea ce este suficient de sensibil pentru studiile farmacocinetice.

3.3.3. Precizia și acuratețea

În acest test, precizia și acuratețea intra- și interzilnică au fost analizate la trei niveluri de concentrație în șase repetiții. Datele au fost afișate în tabelul 3. RSD a preciziei intra- și interzilnice au fost cuprinse între 0,7 și 9,3%. RE al acurateței a fost cuprins între ±14,0%. Rezultatele sugerează că metoda este precisă și repetabilă pentru analiza tuturor analiților din plasma de șobolan.

3.3.4. Recuperarea extracției și efectul matricei

Toate datele privind recuperarea extracției și efectul matricei au fost rezumate în tabelul 4. Recuperarea prin extracție a 11 ingrediente la trei niveluri de concentrație a fost cuprinsă între 85,2-109,1%. Efectele de matrice ale tuturor analiților au variat între 89,2 și 113,4%. Datele care manifestă că procedura experimentului este eficientă și că efectele matricei au putut fi ignorate.

3,3,5. Stabilitate

Pentru a investiga stabilitatea analiților, au fost testate probe QC de trei niveluri de concentrație în diferite condiții de depozitare, inclusiv depozitate la autosampler timp de 12 h după preparare, la temperatura camerei timp de 6 h, la trei cicluri de îngheț-dezgheț și la -70°C timp de 14 zile. După cum se arată în tabelul 5, rezultatele sugerează că analiții sunt stabili în condițiile de mai sus.

3,4. Studiu farmacocinetic

Metoda LC-MS/MS validată a fost aplicată la studiul farmacocinetic al celor unsprezece analiți în proba de sânge de șobolan după administrarea orală de TMYX în doză unică de 8,3 g/kg. Principalii parametri farmacocinetici au fost demonstrați în tabelul 6. Iar profilurile medii ale concentrației plasmatice în timp ale celor unsprezece ingrediente active au fost prezentate în figura 3.

Figura 3

Curbele concentrației plasmatice medii în timp a reinei, emodinei, glicozidului stilbenic, liquiritin, ononin, verbascoside, acid galic, schisandrin, liquiritigenin, acid glicirizic și isoliquiritigenin după administrarea orală a extractului TMYX (medie ± SD, n=6).

Tmax-ul reinei, emodinei, glicozidului stilbenic, liquiritinei, ononinei, verbascosidei, acidului galic și schisandrinului sunt 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h și, respectiv, 1,00±0,92 h. Tmax arată că opt ingrediente sunt absorbite rapid. Vârfurile duble sunt detectate în profilurile medii ale concentrației plasmatice în timp pentru liquiritigenină, acid glicirizic și izoliquiritigenină. Primul vârf al celor trei ingrediente a apărut la 0,20 h, 2,13 h și 0,28 h, iar cel de-al doilea vârf la 7,20 h, 17,67 h și, respectiv, 7,00 h. Acesta ar putea rezulta din circulația hepatoenterală. În plasma de șobolan au fost raportate profilele de concentrație plasmatică în timp ale liquiritigeninei, isoliquiritigeninei și acidului glicirizic în urma administrării orale de Radix glycyrrhizae sau a combinației de Radix glycyrrhizae și Ramulus cinnamomi . Diferențele pot proveni din efectele altor plante din TMYX, care necesită experimente suplimentare. În afară de vârfurile duble, timpul de înjumătățire de eliminare (t1 /2) a reinei, emodinei, acidului galic, glicirrizinei, glicozidului stilbenic, verbascosidei, formononetinei și schisandrinei variază de la 1,53 h la 4,21 h, ceea ce sugerează că acești opt analiți din proba de sânge de șobolan sunt eliminați rapid după administrarea orală. Tendința farmacocinetică similară a schisandrinei a fost raportată după administrarea orală a extractului apos de Fructus schisandrae . De asemenea, s-a raportat că s-a observat un singur vârf pentru emodin și acidul galic la șobolanul căruia i s-a administrat Radix polygoni multiflori . T1 /2 ale liquiritigeninei, acidului glicirizic și isoliquiritigeninei sunt de 12,70 h, 18,19 h și 13.46 h, ceea ce indică faptul că ingredientul are un timp de tratament mai lung, în special isoliquiritigenina și acidul glicirizic, care pot fi încă detectate in vivo la 48 h.

4. Concluzie

În experimentul nostru, am dezvoltat o metodă de HPLC-MS/MS pentru detectarea reinei, emodinei, glicozidului stilbenic, liquiritinei, ononinei, verbascosidei, acidului galic, schisandrinei, liquiritigeninei, acidului glicirizic și isoliquiritigeninei în plasma de șobolan. Parametrii farmacocinetici ar fi de ajutor pentru dezvoltarea și utilizarea ulterioară a TMYX în clinică. Cele 11 ingrediente active din TMYX, care au fost absorbite în plasmă, ar oferi suport de date pentru îmbunătățirea controlului de calitate.

Disponibilitatea datelor

Datele utilizate pentru a susține concluziile acestui studiu sunt disponibile la cerere la autorul corespondent.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Recunoștințe

Acest studiu a fost susținut de Fundația Națională de Științe Naturale a Chinei (81673824 și 81503457) și de Proiectul de cercetare al Comisiei Municipale de Educație din Tianjin (2017KJ139).

.