HPLC-MS/MS-menetelmän kehittäminen 11 bioaktiivisen yhdisteen määrittämiseksi Tongmai Yangxin -pillereissä ja soveltaminen farmakokineettiseen tutkimukseen rotilla

Abstract

Herkkä ja luotettava HPLC-MS/MS-menetelmä kehitettiin ja validoitiin yhdentoista bioaktiivisen yhdisteen (rhein, emodiini, stilbeeniglykosidi, likiritiini, ononiini, verbaskosidi, gallushappo, skisandriini, likiritigeniini, glysyrritsiinihappo ja isoliquiritigeniini) rottien plasmassa Tongmai Yangxin -pillerin oraalisen annon jälkeen. Kerätyt plasmanäytteet valmistettiin neste-nesteuutolla etyyliasetaatilla happamuuden lisäämisen jälkeen. Yksitoista yhdistettä erotettiin CORTECS™ C18 -kolonnilla liikkuvilla faaseilla, jotka koostuivat 0,1 % muurahaishaposta deionisoidussa vedessä ja asetonitriilissä. Virtausnopeus oli 0,3 ml/min. Detektointi suoritettiin tandem-massajärjestelmällä, jossa oli sähkösuihkuionisaatiolähde (ESI) sekä positiivisella että negatiivisella ionisaatiolla käyttäen monireaktiomittaustilaa (MRM). Kalibrointikäyrät olivat lineaarisia välillä 8-2000 ng/ml glysyrritsiinihapon osalta; 4-1000 ng/ml likiritiinin osalta; 0,8-200 ng/ml emodiinin, gallushapon, ononinin, skisandriinin ja stilbeeniglykosidin osalta; 0,4-100 ng/ml isolikiritigeniinin, likiritigeniinin, rheiinin ja verbaskosidin osalta. Analyyttien vuorokauden sisäinen ja vuorokauden välinen tarkkuus oli alle 9,3 % ja 8,5 %. Päivän sisäinen ja päivän välinen tarkkuus oli välillä -14,0-10,3 % ja -6,5-9,6 %. Samaan aikaan analyyttien talteenotto plasmanäytteistä vaihteli 85,2 prosentista 109,1 prosenttiin ja matriisivaikutus 89,2 prosentista 113,4 prosenttiin. Kehitettyä menetelmää sovellettiin menestyksekkäästi yhdentoista bioaktiivisen yhdisteen farmakokinetiikkaan rotan plasmassa Tongmai Yangxin Pill reseptin oraalisen annon jälkeen.

1. Johdanto

Perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on luonnon arvokas aarre. TCM:ää on käytetty kliinisessä käytössä tuhansia vuosia, ja se on herättänyt yhä enemmän huomiota, koska sillä on voitu hoitaa erilaisia sairauksia menestyksekkäästi ja mahdollisimman vähäisin sivuvaikutuksin . TCM-resepti, joka on kliinisessä lääkehoidossa yleisimmin käytetty muoto, on monikomponenttinen ja monitavoitteinen. Monikomponentit ja multitavoitteet ovat TCM:n farmakologisten toimien ylivertaisuutta ja ominaispiirteitä .

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) on perinteinen kiinalainen patenttilääke, joka on dokumentoitu Kiinan farmakopeaan. Resepti kehitettiin tunnetusta yrttiparista ”GuiZhi-GanCao”, joka on dokumentoitu Zhongjing Zhangin ”Shang-Han-Lunissa” itäisen Han-dynastian aikana. Resepti koostuu yhdestätoista yrtistä, joihin kuuluvat Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis ja Fructus jujubae . TMYX:ää on käytetty sepelvaltimotaudin, rytmihäiriöiden, rintakivun ja angina pectoriksen hoitoon useiden vuosikymmenien ajan . Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset osoittavat, että TMYX:llä on merkittävä vaikutus sydänsairauksiin. TMYX:n neljällä aktiivisella flavonoidiyhdisteellä (glyasperiini A, glykykumariini, licorisoflavaani A ja likoisoflavoni A) todettiin olevan tyydyttävä biologinen aktiivisuus ja ne edistävät ihmisen napalaskimon endoteelisolujen proliferaatiota ja angiogeneesiä seeprakalassa. Samaan aikaan Liu et al. raportoivat, että TMYX:n viiden fraktion havaittiin harjoittavan antiepiteliaalista-mesenkymaalista siirtymäaktiivisuutta . Taon tulokset osoittivat, että kuusi aktiivista ainesosaa, joilla on korkeat R-arvot (gomisiini D, skisandriini, glysyrritsiinihappo, stilbeeniglykosidi, formononetiini ja ononiini), vaikuttavat annosriippuvaisesti tulehdusta ehkäisevästi.

TMYX:n farmakologiset vaikutukset perustuvat monipuoliseen kemialliseen koostumukseen. Chen raportoi, että 80 yhdistettä tunnistettiin tai oletettiin HPLC-MS: n avulla, mukaan lukien 23 flavonia ja niiden glukuronidit, 6 fenetyylialkoholiglykosidia, 20 triterpeenisaponiineja, 15 lignaania ja 18 muuta yhdistettä . Fan luonnehti 40 imeytynyttä bioaktiivista komponenttia TMYX:n oraalisen annon jälkeen rotan seerumissa UPLC/Q-TOF-MS:llä . Näistä 40 komponentista 2 oli peräisin Radix rehmanniae -kasvista, 10 Radix codonopsis -kasvista, 2 Radix ophiopogonis -kasvista, 2 Ramulus cinnamomi -kasvista, 19 Radix glycyrrhizae -kasvista, 2 Radix polygoni multiflori preparata -kasvista, 5 Caulis spatholobi -kasvista, 1 Fructus jujubae -kasvista ja 1 Fructus schisandrae -kasvista, joista jotkin olivat päällekkäisiä. Useimmilla ainesosilla on anti-inflammatorisia ja antioksidatiivisia vaikutuksia, ja lisäksi niillä on sydän- ja verisuonitauteja suojaava vaikutus. Ryhmä määrittää myös liquiritiinin, liquiritigeniinin, isoliquiritigeniinin, glykyrritsiinihapon ja glykyrretiinihapon pitoisuudet rottien plasmassa Radix glycyrrhizaen tai Radix glycyrrhizaen ja Ramulus cinnamomin yhdistelmän oraalisen annon jälkeen HPLC-UV:llä. Ei kuitenkaan ole julkaisua, jossa raportoitaisiin TMYX:n farmakokineettisestä tutkimuksesta.

TCM-lääkkeiden farmakokinetiikka (PK) on yksi TCM-lääkkeiden farmakologian osa-alue. TCM-lääkkeiden PK keskittyy tutkimaan kvantitatiivisesti lääkkeen imeytymisen, jakautumisen, metabolian ja erittymisen lakeja elävässä organismissa. TCM-reseptin monikomponenttien PK-tutkimus on ollut yksi TCM:n nykyaikaistamisen tärkeistä tutkimusnäkökohdista. PK-tiedot voisivat selventää aineen perustaa ja paljastaa TCM-lääkkeiden tieteellisen merkityksen. Sillä on myös tärkeä rooli uusien kiinalaisten lääkkeiden luomisessa, annostelumuotojen parantamisessa ja formulaatiomekanismin mekanismissa. Tässä tutkimuksessa kehitettiin ensin luotettava ja herkkä HPLC-MS/MS-menetelmä, jota sovellettiin 11 bioaktiivisen komponentin, mukaan lukien reiini, emodiini, stilbeeniglykosidi, likiritiini, ononiini, verbaskosidi, galliinihappo, skisandriini, likiritigeniini, glysyrritsiinihappo ja isoliquiritigeniini, farmakokineettiseen tutkimukseen rotilla TMYX:n oraalisen annon jälkeen. TMYX:n tärkeimpien kemiallisten komponenttien farmakokineettiset ominaisuudet rotilla paljastuivat, mikä tarjoaisi teoreettisen perustan TMYX:n käytölle kliinisessä käytössä.

2. Kokeellinen

2.1. Farmakokineettiset ominaisuudet. Kemikaalit, reagenssit ja materiaalit

Metanoli (kromatografinen puhtaus) ja asetonitriili (kromatografinen puhtaus) ostettiin Merck Co., Ltd:ltä. Muurahaishappo (kromatografinen puhtaus) saatiin ROE Co., Ltd.:ltä. Erittäin puhdas vesi valmistettiin Milli-Q-vedenpuhdistusjärjestelmällä (Millipore, Milford, MA, USA). Rein, emodiini, stilbeeniglykosidi, likiritiini, ononiini, verbaskosidi, galliinihappo, skisandriini, likiritigeniini, glysyrritsiinihappo, isolikiritigeniini ja ikariini ostettiin Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd.:ltä. (Chengdu, Kiina). TMYX:n toimitti Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.

2.2. Kromatografiset ja massaspektrometriset olosuhteet

HPLC-MS/MS-järjestelmä koostuu Agilent 1200 -hyötysuorituskykyisestä nestekromatografista, joka on yhdistetty Aglient 6430 -sarjan kolmoiskvadrupoli-massaspektrometriin, jossa on sähkösuihkuionisaatiolähde (ESI). Kromatografinen erottelu tehtiin CORTECS C18 -kolonnilla (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), ja kolonnin lämpötila pidettiin 30 °C:ssa. Liikkuvia faaseja, jotka koostuivat 0,1 % muurahaishaposta vedessä (A) ja asetonitriilistä (B), käytettiin seuraavassa gradienttieluutiomenetelmässä: Virtausnopeudeksi asetettiin 0,3 ml/min, ja injektiotilavuus oli 10 μl. Kaikki tiedot analysoitiin Mass Hunter -työasemaohjelmistolla (Agilent Technologies, USA).

Massaspektrometri suoritettiin sekä positiivisen että negatiivisen ionisaation monireaktiomittaustilassa (MRM). Lähdeparametrit olivat seuraavat: kapillaarijännite asetettiin 300 V:ksi positiivisen ionisaation tilassa ja -300 V:ksi negatiivisen ionisaation tilassa, kuivauskaasun lämpötila oli 320 °C, virtaus oli 11 L/min ja sumutuskaasun paine oli 30 psi. Ainesosien esiaste ja tuotanto sekä MRM-parametrit oli esitetty taulukossa 1.

Yhdisteet Esiaste-ioni (m/z) Tuote-ioni (m/z) Frag. (V) C.E. (V) rhein 238.9 211.0 140 -10 emodiini 269.0 225.0 145 -20 stilbeeniglykosidi 405.2 242.8 145 -13 likviittiini 417.1 255.0 145 -13 ononin 431.2 269.1 10 13 verbaskosidi 623.0 161.1 116 -33 galuliinihappo 169.0 125.1 123 -12 schisandriini 433.3 384.2 100 14 liquiritigeniini 255.3 119.1 121 -24 glysyrritsiinihappo 821.1 350.5 125 -40 isolikviiritigeniini 255.1 118.9 106 -23 icariin (IS) 721.0 513.2 145 -10

Taulukko 1

Massaspektriominaisuudet 11:stä analyytistä ja IS:stä.

2.3. TMYX-uutteen valmistus

TMYX-uute valmistettiin seuraavasti: Yhteensä 100 g TMYX-jauhetta punnittiin tarkasti ja uutettiin kahdesti lämpöfrekvenssissä neljällä kertaa 60 % etanolilla (v/v) 1 tunnin ajan kerrallaan. Tämän jälkeen uuttoliuokset suodatettiin ja sekoitettiin. Sekoitettu liuos väkevöitiin haihduttamalla alennetussa paineessa. Tämän jälkeen kuivatut uutteet murskattiin jauheeksi ja säilytettiin eksikaattorissa analyysiin asti. Uutteet sisälsivät reiinia, emodiinia, stilbeeniglykosidia, likiritiiniä, ononiinia, verbaskosidia, galliinihappoa, skisandriiniä, likiritigeniiniä, glykyrritsiinihappoa ja isolikiritigeniiniä 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7 ja 9,6 μg/g. Tutkimuksen yhdisteiden rakenteet on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1

Yhdentoista komponentin kemialliset rakenteet.

2.4. Aineen rakenne. Kalibrointiliuosten ja laadunvalvontanäytteiden valmistaminen

Kantaliuoksen valmistamiseksi punnittiin erikseen reiini, emodiini, stilbeeniglykosidi, likiritiini, ononiini, verbaskosidi, galliinihappo, skisandriini, likiritigeniini, glykyrritsiinihappo, isolikiritigeniini ja ikariini (sisäinen standardiliuos) ja laimennettiin metanolilla lopulliseen pitoisuuteen 1 mg/ml. Seosstandardiliuos saatiin sekoittamalla sopiva määrä yhdestätoista kantaliuoksesta ja laimennettiin metanolilla.

Kalibrointiliuokset valmistettiin piikittämällä 20 μl seosstandardiliuosta ja 20 μl IS:tä 100 μl:aan nollatilavuuteen rotan plasmaa. Sarjan analyyttien lopulliset pitoisuudet olivat välillä 8-2000 ng/ml glysyrritsiinihapon osalta; 4-1000 ng/ml likiritiinin osalta; 0,8-200 ng/ml emodiinin, gallushapon, ononinin, skisandriinin ja stilbeeniglykosidin osalta; ja 0,4-100 ng/ml isolikiritigeniinin, likiritigeniinin, riinin ja verbaskosidin osalta.

Laadunvalvontanäytteet (QC-näytteet) kolmella pitoisuudella (matala, keskipitoisuus ja korkea pitoisuus) muodostettiin sopivista sekoitetuista standardiliuoksista ja nollaverinäytteestä kalibrointiliuoksina vaadittujen pitoisuuksien täyttämiseksi. Kaikki liuokset säilytettiin 4 °C:ssa.

2.5. Plasmanäytteen valmistelu

Plasmanäytteeseen (100 μL) lisättiin 20 μL metanolia, 20 μL IS:ää (icariiniä, 1 μg/ml) ja 20 μL muurahaishappoa, minkä jälkeen se sekoitettiin vortexillä. Seos uutettiin 800 μL:lla etyyliasetaattia vorteksisekoittamalla 5 minuutin ajan huoneenlämmössä. Sentrifugoinnin jälkeen 14 000 rpm 10 minuutin ajan supernatantti kerättiin puhtaaseen putkeen ja haihdutettiin kuivaksi typpivirrassa. Jäännös palautettiin 50 μl:aan 50-prosenttista metanolia, vorteksoitiin 5 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 14 000 rpm 10 minuutin ajan. Lopuksi 10 μL supernatanttia injektoitiin LC-MS/MS-järjestelmään analysointia varten.

2.6. Menetelmän validointi

2.6.1. Spesifisyys

Spesifisyys arvioitiin analysoimalla kuuden eri rotan nollaverinäytteitä. Kukin plasmanäyte arvioitiin endogeenisen interferenssin varalta käyttäen edellä ehdotettua uutto-ohjelmaa ja LC-MS/MS-olosuhteita.

2.6.2. Verensokeri. Lineaarisuus ja LLOQ

Lineaarisuus saavutettiin analysoimalla rottien nollaplasmaa vakavalla sekoitetulla standardiliuoksella ja IS:llä kaksoiskappaleina kolmena peräkkäisenä päivänä. Kalibrointikäyrät piirrettiin analyytin ja sisäisen standardin piikin pinta-alan suhteilla (y) suhteessa nimellispitoisuuteen (x). Painokerroin on 1/x. Määrityksen alaraja (LLOQ) arvioitiin perusviivakohinan mukaan, jolloin signaali-kohinasuhteeksi määritettiin noin 10.

2.6.3. Tarkkuus ja täsmällisyys

Tarkkuus ja täsmällisyys arvioitiin määrittämällä QC-näytteet pienillä, keskisuurilla ja suurilla pitoisuustasoilla (20, 200 ja 2000 ng/ml glykyrritsahapon osalta; 10, 100 ja 1000 ng/ml likiritiinille; 2, 20 ja 200 ng/ml emodiinille, gallushapolle, ononiinille, skisandriinille ja stilbeeniglykosidille; 1, 10 ja 100 ng/ml isolikiritigeniinille, likiritigeniinille, reiinille ja verbaskosidille). Kaikki pitoisuudet mitattiin kuudesta toistosta. Tarkkuus ja tarkkuus testattiin kerran päivässä ja toistettiin kolmena peräkkäisenä päivänä standardikalibrointikäyrällä. Päivänsisäinen ja päivänsisäinen tarkkuus määritettiin suhteellisena standardipoikkeamana (RSD), kun taas tarkkuus määritettiin suhteellisen virheen (RE %) avulla.

2.6.4. Uuttamisen palautuminen ja matriisivaikutus

Yhdentoista analyytin uuttamisen palautuminen kolmella pitoisuustasolla ja IS:llä määritettiin vertaamalla uutetuista näytteistä saatuja piikkien pinta-aloja uutettujen näytteiden pinta-aloihin. Näytteiden ja IS:n matriisivaikutus arvioitiin piikkipinta-alojen suhdeluvuilla, jotka saatiin piikitetyistä näytteistä ja uuttamattomista näytteistä. Sekä uuton talteenottoa että matriisivaikutusta testattiin kuudessa rinnakkaisessa testissä.

2.6.5. Stabiilisuus

Plasmanäytteiden analyyttien stabiilisuus määritettiin analysoimalla kolmen konsentraatiotason QC-näytteitä eri olosuhteissa: säilytettiin automaattisessa näytteenottimessa 12 tuntia, huoneenlämmössä 6 tuntia, kolmessa jäädytys-sulatussyklissä ja varastoitiin -70 °C:ssa 14 päivän ajan. Kaikki stabiilisuustutkimukset mitattiin kuudella toistolla.

2.7. Farmakokineettinen tutkimus

Isoiset Sprague-Dawley-rotat (230-250 g) saatiin Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd.:ltä. Rotat pidettiin kontrolloiduissa ympäristöolosuhteissa, ja ne paastosivat 12 tuntia ja saivat vapaasti vettä ennen kokeita. TMYX-uutteet liuotettiin CMC-Na:han ja annettiin rotille suun kautta 8,3 g/kg. Verinäytteet (200 μl) kerättiin rotan fossa orbitalis -suonesta 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 ja 48 tuntia oraalisen annostelun jälkeen heparinoituihin putkiin. Sitten verinäytteet sentrifugoitiin 7000 rpm 10 minuutin ajan plasmanäytteen saamiseksi välittömästi. Lopuksi saatu plasma säilytettiin -70 °C:ssa analyysiin asti. Farmakokineettiset parametrit laskettiin tietokoneohjelmalla ”Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, Kiina).

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Farmakokinetiikka. HPLC-MS/MS-menetelmä

Testattiin useita liikkuvia faaseja. Verrattuna gradienttiliikkuvaan faasijärjestelmään, jossa oli asetonitriili – vesi tai metanoli – vesi, liikkuva faasi, joka sisältää 0,1 % muurahaishappoa vedessä, pystyi parantamaan piikin muotoa ja lisäämään analyyttien signaalivastetta. Niinpä valitsimme liikkuvaksi faasiksi 0,1 % muurahaishappoa sisältävän veden.

Massaspektrometriin injektoitiin vastaavasti analyyttien standardiliuokset ja sisäinen standardi. Ononiini ja skisandriini testattiin positiivisessa ionimoodissa, kun taas muut negatiivisessa. Optimoituja prekursori-tuotos-siirtymiä seurattiin: 238,9→211,0 rheinille, 269,0→225,0 emodiinille, 405,2→242,8 stilbeeniglykosidille, 417,1→255,0 liquiritiinille, 431,2→269,1 ononiinille, 623.0→161.1 verbaskosidille, 169.0→125.1 galliinihapolle, 433.3→384.2 skisandriinille, 255.3→119.1 likiritigeniinille, 821.1→350.5 glysyrritsiinihapolle, 255.1→118.9 isolikiritigeniinille ja 721.0→513.2 IS. Kaikki tiedot on esitetty taulukossa 1.

3.2. Näytteen valmistelu

Kokeessa testattiin kahta menetelmää plasmanäytteen hävittämiseksi, mukaan lukien neste-nesteuutto (LLE) ja proteiinien saostus (PPT). Tulokset osoittavat, että sekä menetelmien saanto että matriisivaikutukset täyttävät biologisten näytteiden määritykselle asetetut vaatimukset eivätkä endogeeniset aineet häiritse analyysia. PPT-menetelmä osoitti kuitenkin suhteellisesti alhaisempaa uuttotehokkuutta ja suurempaa matriisivaikutusta. Näin ollen valitsimme näytteen valmistukseen neste-nesteuuton (LLE) etyyliasetaatilla

3.3. Menetelmän validointi

3.3.1. Spesifisyys

Spesifisyys arvioitiin vertaamalla kuuden eri rotan tyhjien verinäytteiden kromatogrammeja analyyttejä sisältäviin verinäytteisiin. Käytettiin tyhjän verinäytteen, yksitoista analyyttiä ja IS:ää sisältävän tyhjän verinäytteen ja TMYX-uutteiden oraalisen annon jälkeen rotalta saadun plasmanäytteen edustavia kromatogrammeja. Reinin, emodiinin, stilbeeniglykosidin, likiritiinin, ononinin, verbaskosidin, galliinihapon, skisandriinin, likiritigeniinin, glysyrritsiinihapon, isolikiritigeniinin ja IS:n retentioajat olivat 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41 ja 12,19 minuuttia. Kromatogrammien perusteella plasmanäytteiden endogeeniset aineet eivät häiritse analyyttien ja IS:n määritystä. Kromatogrammit on esitetty kuvassa 2.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 2

Yksitoista analyytin

MRM-kromatogrammit. rhein (1), emodiini (2), stilbeeniglykosidi (3), glysyrritsiinihappo (4), likiritiini (5), likiritigeniini (6), isolikiritigeniini (7), ononiini (8), verbaskosidi (9), galliinihappo (10), skisandriini (11) ja IS (12). (a) Nollaplasma; (b) nollaplasma, johon on lisätty analyyttejä ja IS:tä; (c) plasmanäyte TMYX-uutteen oraalisen annon jälkeen.

3.3.2. Plasmanäytteet. Lineaarisuus ja herkkyys

Kalibrointikäyrien, lineaaristen alueiden, korrelaatiokertoimien ja LLOQ-arvojen tulokset esitetään taulukossa 2. Plasman kalibrointikäyrät rakennettiin alueelle 8-2000 ng/ml glysyrritsiinihapolle; 4-1000 ng/ml likiritiinille; 0,8-200 ng/ml emodiinille, gallushapolle, ononiinille, skisandriinille ja stilbeeniglykosidille; 0,4-100 ng/ml isolikiritigeniinille, likiritigeniinille, rheiinille ja verbaskosidille.

Yhdisteet Kalibrointikäyrät Korrelaatio. kertoimet (r) Lineaarinen alue (ng/mL) LLOQ (ng/mL) rhein y = 0.0954 x + 1.5911 0.9966 0.4 – 100 0.4 emodin y = 1.2189 x + 0.0135 0.9906 0.8 – 200 0.8 stilbeeniglykosidi y = 6.6409 x + 0.0293 0.9991 0.8 – 200 0.8 gallic acid y = 0.9987 x + 0.0104 0.9987 0.8 – 200 0.8 ononin y = 5.4632 x + 0.0058 0.9995 0.8 – 200 0.8 verbaskosidi y = 0.3514 x + 1.9984 0.9965 0.4 – 100 0.4 likiritiini y = 1.1970 x + 0.0085 0.9965 4 – 1000 4 skisandriini y = 2.5769 x + 0.0020 0.9980 0.8 – 200 0.8 liquiritigeniini y = 2.2148 x + 0.0140 0.9997 0.4 – 100 0.4 glysyrritsiinihappo y = 0.0917 x – 0.0028 0.9982 8 – 2000 8 isoliquiritigeniini y = 3.1496 x + 0.0064 0.9986 0.4 – 100 0. Plasmanäytteessä 11 analyytin LLOQ-arvot olivat alle 8 ng/ml, mikä on riittävän herkkä farmakokineettisiin tutkimuksiin. 3.3.3. FARMAKOKINETIIKKA. Tarkkuus ja täsmällisyys Tässä määrityksessä analysoitiin päivänsisäinen ja päivänvälinen tarkkuus ja täsmällisyys kolmella pitoisuustasolla kuudessa toistossa. Tiedot esitettiin taulukossa 3. Päivänsisäisen ja päivänvälisen tarkkuuden RSD oli välillä 0,7-9,3 %. Tarkkuuden RE oli ±14,0 %:n sisällä. Tulokset viittaavat siihen, että menetelmä on tarkka ja toistettavissa kaikkien analyyttien analysoimiseksi rottien plasmasta. yhdisteet Spiktiivinen pitoisuus (ng/ml) Intra-…day Inter-day Measured concentration (ng/mL) Accuracy (RE, %) Tarkkuus (RSD, %) Määritetty pitoisuus (ng/ml) Tarkkuus (RE, %) Tarkkuus (RSD, %) rhein 1 1.00±0.01 0.5 1.2 0.99±0.01 -1.0 1.60±1.52 6.6 1.4 101.83±4.74 1.8 4.7 emodiini 2 2.01±0.10 0.3 4.9 2.00±0.05 0.1 2.7 20 21.72±0.57 8.6 2.6 20.47±1.23 2.3 6.0 200 208.21±1.71 4.1 0.8 201.43±8.99 0.7 4.5 stilbeeniglykosidi 2 1.99±0.06 -0.4 3.0 2.05±0.03 2.3 1.6 20 20.17±0.76 0.8 3.8 19.91±0.73 -0.5 3.7 200 192.33±2.26 -3.8 1.2 192.80±6.57 -3.6 3.4 galuliinihappo 2 1.96±0.05 -2.0 2.6 2.06±0.05 3.1 2.4 20 20.00±0.31 0.1 1.6 20.27±0.61 1.4 3.0 200 186.32±1.66 -6.8 0.9 188.68±3.27 -5.7 1.7 ononin 2 1.96±0.04 -1.9 2.0 1.95±0.03 -2.6 1.4 20 20.59±0.88 3.0 4.3 19.62±1.09 -1.9 5.6 200 208.21±1.71 4.1 0.8 202.11±5.92 1.1 2.9 verbaskosidi 1 0.92±0.01 -7.8 1.5 0.96±0.03 -3.9 3.6 10 9.82±0.36 -1.8 3.7 9.66±0.13 -3.4 1.4 100 102.66±2.89 2.7 2.8 102.03±3.01 2.0 3.0 likviittiini 10 9.45±0.08 -5.5 0.8 9.89±0.49 -1.1 4.9 100 110.26±3.44 10.3 3.1 109.58±2.85 9.6 2.6 1000 1015.89±23.42 1.6 2.3 990.69±29.65 -0.9 3.0 schisandrin 2 2.00±0.04 0.2 2.0 1.89±0.06 -5.4 3.4 20 21.49±0.50 7.5 2.3 20.63±0.70 3.2 3.4 200 199.93±2.23 -0.1 1.1 197.48±3.11 -1.3 1.6 likviritigeniini 1 0.86±0.01 -14.0 1.4 0.93±0.08 -6.5 8.5 10 10.37±0.96 3.7 9.3 9.41±0.50 -5.9 5.3 100 106.60±1.52 6.6 1.4 98.95±7.06 -1.1 7.1 glysyrritsiinihappo 20 18.72±0.53 -0.1 2.8 19.21±0.49 -4.0 2.6 200 218.30±1.48 0.1 0.7 199.59±15.20 -0.2 7.6 2000 2123.83±59.62 0.1 2.8 1980.71±75.51 -1.0 3.8 isoliquiritigenin 1 0.98±0.02 -2.1 2.1 0.98±0.01 -1.6 1.5 10 9.82±0.14 -1.8 1.5 9.72±0.18 -2.8 1.8 100 99.74±0.87 -0.3 0.9 100.71±3.08 0.7 3.1 Taulukko 3 Tarkkuus ja oikeellisuus 11 analyytin määrityksessä rotan plasmassa (n=6). 3.3.4. Uuttamisen talteenotto ja matriisivaikutus Kaikki tiedot uuttamisen talteenotosta ja matriisivaikutuksesta on esitetty yhteenvetona taulukossa 4. Uuttamisen saanto 11 ainesosasta kolmella pitoisuustasolla oli 85,2-109,1 %. Kaikkien analyyttien matriisivaikutukset vaihtelivat välillä 89,2-113,4 %. Tiedot osoittavat, että koemenettely on tehokas ja matriisivaikutukset voidaan jättää huomiotta. Yhdisteet Värjätty konsentraatio (ng/ml) Extraktio talteenotto. (%) RSD (%) Matriisivaikutus (%) RSD (%) rhein 1 96.2±7.4 7.7 104.1±5.6 5.4 10 99.3±3.9 3.9 100.1±2.7 2.7 100 101.4±5.2 5.1 92.6±3.7 4.0 emodiini 2 98.8±3.4 3.5 107.7±2.6 2.4 20 96.2±2.5 2.6 103.6±0.8 0.8 200 86.1±4.2 4.9 104.8±2.9 2.8 stilbeeniglykosidi 2 98.9±1.9 1.9 100.7±2.2 2.2 20 99.3±4.0 4.0 94.6±2.2 2.3 200 96.7±5.6 5.8 98.7±0.8 0.9 gallic acid 2 99.1±3.1 3.2 110.4±5.8 5.2 20 100.9±2.5 2.5 98.3±2.0 2.0 200 85.2±3.0 3.5 108.1±1.3 1.2 ononin 2 91.8±2.7 2.9 98.6±2.8 2.8 20 89.0±3.8 4.3 89.9±0.7 0.8 200 93.1±5.2 5.6 91.7±0.9 1.0 verbaskosidi 1 93.1±4.0 4.3 103.6±3.3 3.1 10 97.0±4.7 4.8 100.0±2.1 2.1 100 92.5±6.1 6.6 98.9±2.3 2.4 likiritiini 10 105.7±4.5 4.3 98.8±1.2 1.2 100 109.1±4.0 3.6 100.1±6.4 6.4 1000 99.5±7.6 7.7 95.2±5.5 5.8 schisandrin 2 98.8±4.1 4.2 96.8±2.6 2.7 20 106.3±1.1 1.0 93.0±1.7 1.8 200 101.0±6.0 5.9 90.4±0.7 0.8 likviritigeniini 1 99.7±3.5 3.6 113.4±2.8 2.5 10 99.5±2.7 2.7 89.2±1.3 1.5 100 96.3±3.4 3.5 99.8±1.8 1.8 glycyrrhizic acid 20 100.9±7.5 7.4 101.6±6.8 6.7 200 97.5±2.1 2.1 102.5±1.3 1.3 2000 87.6±1.6 1.8 103.7±2.1 2.0 isoliquiritigeniini 1 98.0±5.5 5.6 105.73±2.2 2.1 10 96.5±2.0 2.1 98.0±3.6 3.6 100 85.9±5.7 6.7 97.3±3.1 3.2 Taulukko 4 Taulukko 4 Extraktioiden talteenotot ja matriisivaikutukset analyyttien osalta (n=6). Analyyttien stabiilisuuden tutkimiseksi testattiin QC-näytteitä kolmella pitoisuustasolla eri säilytysolosuhteissa, mukaan lukien säilytys autosamplerissa 12 tuntia valmistuksen jälkeen, huoneenlämmössä 6 tuntia, kolmessa jäädytys-sulatussyklissä ja -70 °C:ssa 14 päivän ajan. Kuten taulukosta 5 käy ilmi, tulokset osoittavat, että analyytit ovat stabiileja edellä mainituissa olosuhteissa. Yhdisteet Värjätty pitoisuus (ng/ml) huoneenlämpötilassa 6 h:n ajan kolme pakastus- ja sulatussykliä automaattisella näytteenottimella 12 h:n ajan -70 °C 14 päivän ajan Määritetty pitoisuus (ng ml-1) RSD (%) Määritetty pitoisuus (ng ml-1) RSD (%) Määritetty Pitoisuus (ng ml-1) RSD (%) Mitattu pitoisuus (ng ml-1) RSD (%) rhein 1 0.97±0.02 2.0 0.98±0.03 2.8 0.97±0.01 0.8 0.95±0.05 5.4 10 10.23±0.04 0.4 8.89±0.08 0.9 9.86±0.09 0.9 8.71±0.11 1.3 100 101.97±1.07 1.1 86.7±1.33 1.5 97.32±1.05 1.1 85.95±0.39 0.5 emodiini 2 1.95±0.05 2.3 2.00±0.02 0.9 1.93±0.02 0.8 1.86±0.03 1.6 20 21.14±0.99 4.7 19.21±0.33 1.7 19.88±1.81 9.1 18.79±0.18 0.9 200 207.49±1.27 0.6 197.74±5.65 2.9 200.50±11.66 5.8 185.45±0.98 0.5 stilbeeniglykosidi 2 1.82±0.01 0.8 2.00±0.03 1.6 1.89±0.00 0.1 1.99±0.01 0.3 20 20.88±1.19 5.7 19.87±1.43 7.2 19.00±0.64 3.4 20.01±0.31 1.6 200 202.79±12.80 6.3 200.45±2.10 1.1 182.40±1.23 0.7 203.34±1.39 0.7 gallic acid 2 1.97±0.03 1.5 1.93±0.04 1.8 2.03±0.05 2.3 1.99±0.04 2.0 20 20.77±1.09 5.3 20.08±0.51 2.5 19.27±0.35 1.8 19.26±0.22 1.2 200 205.97±2.14 1.0 196.77±1.09 0.6 184.54±2.46 1.3 199.19±1.80 0.9 ononin 2 2.02±0.03 1.4 1.85±0.01 0.7 1.83±0.01 0.4 1.95±0.01 0.5 20 20.57±0.26 1.2 18.71±0.26 1.4 18.84±0.62 3.3 18.51±0.15 0.8 200 216.32±0.91 0.4 191.28±2.36 1.2 195.34±4.30 2.2 200.23±3.89 1.9 verbaskosidi 1 0.92±0.01 1.0 1.09±0.01 0.9 1.05±0.02 1.8 1.01±0.02 2.3 10 9.57±0.21 2.2 10.17±0.90 8.9 9.50±0.04 0.5 9.81±0.22 2.2 100 103.95±1.33 1.3 108.42±1.17 1.1 93.52±0.27 0.3 107.40±1.47 1.4 liquiritiini 10 9.85±0.09 1.0 9.26±0.16 1.7 10.26±0.11 1.1 10.04±0.12 1.2 100 108.97±1.51 1.4 109.67±1.86 1.7 108.02±0.66 0.6 105.05±1.73 1.7 1000 1076.07±10.27 1.0 952.89±11.22 1.2 869.12±14.52 1.7 1021.69±19.98 2.0 schisandrin 2 2.00±0.04 1.8 1.71±0.01 0.6 1.83±0.02 1.1 1.77±0.03 1.7 20 21.15±0.50 2.4 18.28±0.23 1.2 18.35±0.09 0.5 17.86±0.20 1.1 200 194.61±1.13 0.6 189.32±1.74 0.9 196.02±2.10 1.1 183.83±1.00 0.6 likviritigeniini 1 0.87±0.01 0.9 0.89±0.02 1.8 0.87±0.01 1.1 0.88±0.02 2.1 10 10.82±0.58 5.3 8.99±0.07 0.8 8.63±0.23 2.7 9.26±0.08 0.9 100 112.69±1.30 1.2 92.59±0.63 0.7 92.65±0.68 0.7 91.88±0.86 0.9 glysyrritsiinihappo 20 20.49±0.79 3.9 19.30±0.20 1.0 19.25±0.34 1.8 18.77±0.09 0.5 200 203.22±3.32 1.6 188.63±3.57 1.9 200.96±3.93 2.0 200.33±2.98 1.5 2000 2099.10±8.92 0.4 1869.00±42.55 2.3 1884.66±9.26 0.5 1834.54±29.34 1.6 isoliquiritigenin 1 0.99±0.01 1.5 0.89±0.02 2.4 1.00±0.02 1.7 0.89±0.01 1.4 10 10.86±0.60 5.5 8.69±0.14 1.6 9.60±0.04 0.4 8.62±0.04 0.4 100 106.11±0.78 0.7 100.58±0.91 0.9 97.47±1.99 2.0 100.74±2.95 2.9 Taulukko 5. Kaikkien analyyttien säilyvyys rottien plasmassa (n=6). 3.4. Farmakokineettinen tutkimus Validoitua LC-MS/MS-menetelmää sovellettiin yhdentoista analyytin farmakokineettiseen tutkimukseen rotan verinäytteessä sen jälkeen, kun TMYX:ää oli annettu suun kautta kerta-annoksena 8,3 g/kg. Tärkeimmät farmakokineettiset parametrit on esitetty taulukossa 6. Ja yhdentoista vaikuttavan aineen keskimääräiset pitoisuus-aikaprofiilit plasmassa oli esitetty kuvassa 3. Yhdisteet Tmax1 (h) Tmax2 (h) Cmax1 (ng/ml) Cmax2 (ng/ml) t1/2 (h) Ke (1/h) (h-ng/mL) (h-ng/mL) Rein 0.36±0.31 46.3±15.6 2.84±2.13 0.56±0.50 145.0±52.6 152.1±61.3 emodiini 0.32±0.14 88.0±37.5 4.21±2.63 0.39±0.28 475.5±121.0 561.3±192.3 stilbeeniglykosidi 0.50±0.31 99.1±27.1 1.99±1.31 0.45±0.24 283.8±189.1 297.5±185.3 likviittiini 0.50±0.46 199.9±120.2 2.16±1.44 0.77±0.54 637.2±220.2 651.1±219.5 ononin 0.46±0.10 14.4±6.8 2.85±1.40 0.37±0.25 58.2±20.2 69.4±28.5 verbaskosidi 0.37±0.18 23.4±8.7 1.53±0.67 0.56±0.31 51.4±29.8 61.0±29.8 gallic acid 0.75±0.67 56.9±42.8 3.01±1.35 0.27±0.12 214.7±136.7 238.4±172.8 schisandrin 1.00±0.92 92.6±53.0 2.73±1.54 0.34±0.19 410.8±238.9 473.4±321.2 liquiritigeniini 0.20±0.07 7.20±3.35 37.8±24.1 21.0±15.3 12.70±7.04 0.50±0.34 314.8±129.8 332.6±142.1 glycyrrhizic acid 2.13±1.44 17.67±10.31 351.7±347.4 476.1±146.0 18.19±9.61 0.05±0.03 12743.5±5058.2 17327.3±10967.3 isoliquiritigenin 0.28±0.11 7.00±2.45 41.6±24.2 24.9±13.5 13.46±8.33 0.07±0.04 410.0±130.7 436.2±154.1 Taulukko 6 11 analyytin farmakokineettiset parametrit TMYX-uutteen oraalisen annostelun jälkeen (n=6). Kuva 3 Reinin, emodiinin ja stilbeeniglykosidin keskimääräiset pitoisuus-aikakäyrät plasmassa, likiritiini, ononiini, verbaskosidi, galliinihappo, skisandriini, likiritigeniini, glysyrritsiinihappo ja isolikiritigeniini TMYX-uutteen oraalisen annon jälkeen (keskiarvo ± SD, n=6). Reinin, emodiinin, stilbeeniglykosidin, likiritiinin, ononinin, verbaskosidin, gallushapon ja skisandriinin Tmax-arvot ovat 0.36±0,31 h, 0,32±0,14 h, 0,50±0,31 h, 0,50±0,46 h, 0,46±0,10 h, 0,37±0,18 h, 0,75±0,67 h ja 1,00±0,92 h. Tmax osoittaa, että kahdeksan ainesosaa imeytyy nopeasti. Kaksoishuiput havaitaan keskimääräisissä plasman pitoisuus-aikaprofiileissa likiritigeniinille, glykyrritsiinihapolle ja isolikiritigeniinille. Kolmen ainesosan ensimmäinen huippu ilmeni 0,20 h, 2,13 h ja 0,28 h kohdalla ja toinen huippu vastaavasti 7,20 h, 17,67 h ja 7,00 h kohdalla. Se saattaa johtua hepatoenteraalisesta kierrosta. Rottaplasmassa raportoitiin yksi huippu liquiritigeniinin, isoliquiritigeniinin ja glykyrritsiinihapon pitoisuus-aikaprofiileista plasmassa Radix glycyrrhizaen tai Radix glycyrrhizaen ja Ramulus cinnamomin yhdistelmän oraalisen annon jälkeen. Erot voivat johtua muiden yrttien vaikutuksista TMYX:ssä, mikä edellyttää lisäkokeita. Kaksoishuippujen lisäksi riinin, emodiinin, gallushapon, glysyrritsiinin, stilbeeniglykosidin, verbaskosidin, formononetiinin ja skisandriinin eliminaation puoliintumisaika (t1 /2) vaihtelee 1,53 h:sta 4,21 h:iin, mikä viittaa siihen, että nämä kahdeksan analyyttiä eliminoituvat rotan verinäytteestä nopeasti oraalisen annon jälkeen. Samanlainen skisandriinin farmakokineettinen suuntaus raportoitiin Fructus schisandrae -vesiuutteen oraalisen annon jälkeen. Lisäksi raportoitiin, että emodiinille ja galliinihapolle havaittiin yksi huippu rotilla, joille annosteltiin käsitelty Radix polygoni multiflori . Likiritigeniinin, glykyrritsiinihapon ja isolikiritigeniinin t1 /2 -arvot ovat 12,70 h, 18,19 h ja 13 .46 h, mikä osoittaa, että ainesosalla on pidempi käsittelyaika, erityisesti isoliquiritigeniinillä ja glykyrritsiinihapolla, jotka voidaan havaita in vivo vielä 48 h kuluttua. 4. Johtopäätökset Kokeessamme kehitimme HPLC-MS/MS-menetelmän riinin, emodiinin, stilbeeniglykosidin, likiritiinin, ononinin, verbaskosidin, gallushapon, skisandriinin, likiritigeniinin, glykyrritsahapon ja isoliquiritigeniinin havaitsemiseksi rottien plasmassa. Farmakokineettiset parametrit olisivat hyödyllisiä TMYX:n jatkokehityksessä ja kliinisessä käytössä. TMYX:n 11 vaikuttavaa ainetta, jotka imeytyivät plasmaan, antaisivat tukea laadunvalvonnan parantamiseen. Tietojen saatavuus Tämän tutkimuksen tulosten tukena käytetyt tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta kirjoittajalta. Interintäristiriidat Tekijät ilmoittavat, ettei eturistiriitoja ole. Kiitokset Tätä tutkimusta ovat tukeneet Kiinan kansallinen luonnontieteellinen tutkimussäätiö (81673824 ja 81503457) ja Tianjinin kunnan koulutuskomission tutkimusprojekti (2017KJ139).