Tongmai Yangxin Pillに含まれる11種の生物活性化合物を定量するHPLC-MS/MS法の開発とラットにおける薬物動態試験への応用

Abstract

11種の生物活性化合物の同時定量を目的とした感度と信頼性に優れたHPLC-MS/MS法の開発および検証を行った（Rhein, J.S.A. et al, エモジン，スチルベン配糖体，リキリチン，オノニン，ベルバスコシド，没食子酸，シサンドリン，リキリチゲニン，グリチルリチン酸およびイソリキリチゲニン）． 採取した血漿試料は、酸性化後、酢酸エチルによる液液抽出により調製した。 11種類の化合物をCORTECS™C18カラムで分離し、移動相は脱イオン水中の0.1%ギ酸とアセトニトリルから構成されました。 流速は0.3 mL/minでした。 検出はエレクトロスプレーイオン化 (ESI) 源を備えたタンデムマスシステムで、多重反応モニタリング (MRM) モードを使用して正負両イオン化で行いました。 検量線はグリチルリチン酸で8-2000 ng/mL, リキリチンで4-1000 ng/mL, エモジン，没食子酸，オノニン，スキサンドリンおよびスチルベン配糖体で0.8-200 ng/mL, イソキリティゲニン，リキリチゲニン，レインおよびバーバスコサイドで0.4-100 ng/mL で直線となり，それぞれ測定可能であった。 分析値の日内精度は9.3%以下，日間精度は8.5%以下であった． また，日内精度は-14.0%から10.3%，日間精度は-6.5%から9.6%の範囲であった． また，血漿中の分析対象成分の抽出回収率は85.2%から109.1%であり，マトリックス効果は89.2%から113.4%であった。 開発した方法は，同麻養心薬処方を経口投与したラット血漿中の11種の生理活性物質の薬物動態に適用することができた

1. はじめに

中国伝統医学（TCM）は、自然界の貴重な宝物である。 中医薬は数千年にわたり臨床で使用されており、副作用が少なく、多様な疾患の治療に成功しているため、注目されている。 中医薬の処方は，臨床薬物療法で最もよく使用される形態であり，多成分・多目標である。

同舞陽鍼薬（TMYX）は、中国薬局方に収載されている中国伝統の特許薬である。 東漢時代の張仲景の「上漢倫」に記載されている有名な生薬「桂枝加人参」の組み合わせから開発された処方です。 この処方は、Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis, Fructus jujubae など11の生薬から構成されています。 TMYXは、数十年にわたり、冠動脈疾患、不整脈、胸痛、狭心症の治療に使用されてきた。 現代の薬理学的研究は、TMYXが心臓病に対して大きな効果があることを示している。 TMYXの4つの活性フラボノイド化合物（グリャスペリンA、グリシクマリン、リコリスフラバンA、リコイソフラボンA）は、十分な生物活性を持ち、ゼブラフィッシュにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖と血管新生を促進することが判明した … 一方、Liuらは、TMYXの5つのフラクションが抗上皮間葉転換活性を発揮することを見出したと報告した . Taoは、R値の高い6つの有効成分（gomisin D, schisandrin, glycyrrhizic acid, stilbene glycoside, formononetin, and ononin）が用量依存的に抗炎症作用を示すことを示した.

TMYXの薬理作用は多様な化学組成に基づいていると言える. Chenは、23のフラボンとそのグルクロニド、6のフェネチルアルコール配糖体、20のトリテルペンサポニン、15のリグナン、および他の18の化合物を含む80の化合物がHPLC-MSを用いて特定または推論されたことを報告した。 TMYXの経口投与によりラット血清中に吸収された40種類の生理活性成分の特性をUPLC/Q-TOF-MSで解析した。 その40成分とは、Radix rehmanniaeから2成分、Radix codonopsisから10成分、Radix ophiopogonisから2成分、Ramulus cinnamomiから2成分、 Radix glycyrrhizaeから19成分、 Radix polygoni multiflori preparataから2成分、 Caulis spatholobiから5成分、 Fructus jujubaeから1成分およびFructus schisandrae から1成分、その一部は重なり合っています。 ほとんどの成分が抗炎症作用と抗酸化作用を発揮し、さらに心血管系保護作用を発揮しています。 また、Radix glycyrrhizaeまたはRadix glycyrrhizaeとRamulus cinnamomiの組み合わせの経口投与後のラット血漿中のリキリチン、リキリチゲニン、イソリキリチゲニン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸の濃度をHPLC-UVで決定している。 しかし，TMYXの薬物動態試験を報告した論文はない。

中薬の薬物動態（PK）は，中薬の薬理学の一分野である。 中医薬の薬物動態は，生体内における薬物の吸収・分布・代謝・排泄の法則を定量的に研究することに主眼が置かれている。 中医薬の処方における多成分のPK研究は，中医薬の近代化における重要な研究の1つである。 PKデータは、中医薬の物質的基礎を解明し、科学的な意味合いを明らかにすることができる。 また、新しい漢方薬の創製、剤形の改良、製剤メカニズムの解明にも重要な役割を担っている。 本研究では，まず信頼性と感度の高いHPLC-MS/MS法を開発し，TMYXを経口投与したラットにおけるrain，emodin，stilbene glycoside，liquiritin，ononin，verbascoside， gallic acid，scisandrin，liquiritigenin， glycyrrhizic acid，isiquiritigenin など11成分の生物活性成分の薬物動態の検討に適用した。 また，TMYXの主要成分のラットにおける薬物動態学的特性を明らかにし，TMYXの臨床応用のための理論的基盤を提供した。 実験＜7106＞＜7271＞2.1. 化学物質、試薬、および材料

メタノール（クロマトグラフィー純度）およびアセトニトリル（クロマトグラフィー純度）は、メルク株式会社から購入した。 蟻酸(クロマト純度)はROE社から入手した。 超純水は，Milli-Q water purification system (Millipore, Milford, MA, USA)を用いて調製した． ライン、エモジン、スチルベン配糖体、リキリチン、オノニン、ベルバスコシド、没食子酸、シサンドリン、リキリチゲニン、グリチルリチン酸、イソリキリチゲニン、イカリインは成都必生技有限公司から購入した。 (Chengdu, China)から購入した． TMYXはTianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co., Ltd.から供給された

2.2. クロマトグラフィーおよび質量分析条件

HPLC-MS/MS システムは、Agilent 1200 高速液体クロマトグラフィーとエレクトロスプレーイオン化 (ESI) 源を備えた Aglient 6430 シリーズトリプル四重極質量分析器から構成されています。 クロマトグラフィー分離は CORTECS C18 カラム (4.6 mm × 150 mm, 2.7 μm) で行い、カラム温度は 30 ℃に保った。 移動相は0.1%ギ酸水溶液（A）およびアセトニトリル（B）を用い、以下のグラジエント溶出法とした。 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. 流速は 0.3 mL/min, 注入量は 10 μL であった。 すべてのデータはMass Hunterワークステーションソフトウェア(Agilent Technologies, USA)で解析しました。

質量分析計はポジティブおよびネガティブイオン化多重反応モニタリング (MRM) モードで実施されました。 ソースのパラメータは、キャピラリー電圧を正イオン化モードでは300V、負イオン化モードでは-300Vに設定し、乾燥ガス温度は320℃、流量は11L/min、ネブライジングガス圧力は30psiであった。 成分の前駆体および生成物、MRMパラメータは表1に示した。

2.3. TMYX抽出物の調製

TMYX抽出物は、以下のように調製した。 合計100gのTMYX粉末を正確に秤量し、4倍量の60％エタノール（v/v）により加熱還流下で1回当たり1時間、2回抽出した。 その後、抽出液を濾過し、混合した。 混合した溶液を減圧下で蒸発させ濃縮した。 乾燥した抽出液を粉砕し、分析までデシケーターで保存した。 抽出物には、rain, emodin, stilbene glycoside, liquiritin, ononin, verbascoside, gallic acid, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizic acid, and isoliquiritigenin 0.4, 46.3, 231.6, 270.5, 161.1, 27.8, 71.8, 65.2, 16.9, 519.7, 9.6 μg/gの成分が含まれていることが確認されました。 図1

2.4.に示す。 校正液及び品質管理試料の調製

原液は、レイン、エモジン、スチルベン配糖体、リキリチン、オノニン、ベルバスコサイド、没食子酸、シサンドリン、リキリチゲニン、グリチルリチン酸、イソリキリチゲニン、イカリイン（内部標準液）を別々に計量し、メタノールで終濃度1 mg/mLに希釈し作成した。 混合標準液は、11種類の原液を適当量混合し、メタノールで希釈したものです。

校正液は、混合標準液20μLとIS20μLをブランクラット血漿100μLに添加し、調製しました。 最終濃度はグリチルリチン酸で8-2000 ng/mL、リキリチンで4-1000 ng/mL、エモジン、没食子酸、オノニン、スキサンドリン、スチルベン配糖体で0.8-200 ng/mL、イソリキリチゲン、リキリチゲン、レイン、バーバスコサイドで0.4-100ng/mLであり、これらの分析物は、いずれも高濃度で、かつ安全性が高いことが確認されました。

低濃度、中濃度、高濃度の3つの濃度の品質管理（QC）試料は、必要な濃度を満たすようにブランク血液試料と適切な混合標準溶液を校正溶液として作製した。 なお、溶液はすべて4℃に保たれていた

2.5. 血漿試料の調製

血漿（100μL）にメタノール20μL、IS（イカリイン、1μg/mL）20μL、ギ酸20μLを添加し、ボルテックスミキシングした。 この混合物を室温で5分間ボルテックスミキシングして800μLの酢酸エチルで抽出した。 14,000rpmで10分間遠心分離した後、上清を清浄なチューブに集め、窒素気流下で蒸発乾固させた。 残渣を50μLの50％メタノールに再構成し，5分間ボルテックスした後，14,000rpmで10分間遠心分離した。 最後に上清10μLをLC-MS/MSに注入し、分析した。 メソッドバリデーション

2.6.1. 特異性

6匹のラットから採取したブランク血液を分析し、特異性を評価しました。 各血漿サンプルは、上記の抽出プログラムおよびLC-MS/MS条件にて内因性干渉を評価しました。 2.6.2. 直線性とLLOQ

直線性は、ブランクラット血漿に混合標準溶液とISを連続3日間、二重測定することにより達成されました。 検量線は内標準物質のピーク面積比を公称濃度(x)に対してプロットしたものです。 重み係数は1/xである。 定量下限はS/N比が約10となるように基準線上のノイズで評価しました。 精度と正確性

精度と正確性は、低、中、高濃度のQCサンプル（グリチルリチン酸は20、200、2000ng/mL。 エモジン，没食子酸，オノニン，スキサンドリン，スチルベン配糖体：2，20，200 ng/mL, イソキリティゲニン，リキリチゲニン，レイン，バーバスコサイド：1，10，100 ng/mL）により評価しました。 すべての濃度は6回繰り返し測定された。 精度と正確さは1日1回、標準検量線を用いて連続3日間繰り返し測定した。 精度は相対標準偏差(RSD)、精度は相対誤差(RE %)で算出した。 抽出回収率とマトリックス効果

抽出した試料と抽出後の試料から得られたピーク面積を比較することにより、3つの濃度レベルの11の分析対象物の抽出回収率とISをアッセイしました。 また，抽出試料のピーク面積と抽出後の試料のピーク面積の比から，試料のマトリックス効果およびISを推定した。 抽出回収率およびマトリックス効果については、6つのパラレルで試験を実施しました。 Stability

血漿試料中の分析物の安定性は、オートサンプラーで12時間、室温で6時間、3回の凍結融解サイクル、-70℃で14日間保存した3段階の濃度のQC試料を異なる条件で分析することにより測定されました。 すべての安定性試験は6反復で測定された。

2.7. 薬物動態試験

オスSprague-Dawleyラット（230-250 g）は，北京HFK実験動物技術有限公司から入手した。 ラットはコントロール環境条件下で維持され、実験前に自由に水を摂取できる状態で12時間絶食させた。 TMYX抽出物をCMC-Naに溶解し、8.3 g/kgでラットに経口投与した。 経口投与後0, 0.03, 0.083, 0.17, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48時間にラット眼窩静脈から血液サンプル（200μL）をヘパリンチューブに採血した。 そして、血液試料を7,000 rpmで10分間遠心分離し、血漿試料を直ちに得た。 最後に、得られた血漿は分析まで-70℃で保存した。 薬物動態パラメータは、コンピュータプログラム「Drug and Statistics 2.0 (DAS 2.0) (Medical College of Wannan, China)」によって算出した

3. 結果と考察

3.1. HPLC-MS/MS Method

数種の移動相をテストしました。 アセトニトリル-水またはメタノール-水のグラジエント移動相系と比較して、水に0.1%のギ酸を含む移動相はピーク形状を改善し、分析対象物の信号応答を増加させることができました。 そこで、0.1%ギ酸を含む水を移動相として選択した。

分析対象物の標準溶液と内部標準溶液をそれぞれ質量分析計に注入した。 オノニンとシサンドリンはポジティブイオンモードで、その他はネガティブイオンモードで測定した。 最適化された前駆体から生成物への遷移は、lineが238.9→211.0、emodinが269.0→225.0、stilbene glycosideが405.2→242.8、Liquilitinが417.1→255.0、Ononinが431.2→269.1、 623.1 とモニターされていた。0→161.1（バーバスコサイド）、169.0→125.1（没食子酸）、433.3→384.2（スキサンドリン）、255.3→119.1（リキリチゲニン）、821.1→350.5（グリチルリチン）、255.1→118.9（アイソキリティゲン）、721.0→513.2（IS）が挙げられました。 すべてのデータはTable 1.

3.2 に示した。 Sample Preparation

実験では、血漿サンプルの廃棄方法として、液液抽出（LLE）とタンパク質沈殿（PPT）の2つを試しました。 その結果，各方法とも回収率，マトリックス効果ともに生体試料の定量に必要な条件を満たし，内因性物質も分析に支障をきたさないことが確認された。 しかし，PPTの方法は抽出効率が低く，相対的にマトリックス効果が高いことがわかった。 その結果、酢酸エチルを用いた液液抽出法（LLE）を選択し、試料を調製した

3.3. メソッドバリデーション

3.3.1. 特異性

6種類のラットのブランク血液試料と分析対象物質を含む血液試料のクロマトグラムを比較し、特異性を評価しました。 ブランク血液試料、11種類の分析対象物質とISを含むブランク血液試料、TMYX抽出物を経口投与したラットの血漿試料の代表的なクロマトグラムをアクセスした。 rhein, emodin, stilbene glycoside, liquiritin, ononin, verbascoside, gallic acid, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizic acid, isoliquiritigenin, ISの保持時間はそれぞれ15.93分，17.63分, 11.34, 11.31, 12.21, 11.01 6.48 16.41 13.21 13.34 14.41 12.19 分となり，ISの保持時間はそれぞれ15.93分と12.19分だった。 クロマトグラムから，血漿試料中の内因性物質は，分析対象物およびISの定量を阻害しないことが確認された。 クロマトグラムをFigure 2に示す。

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 2

MRM クロマトグラム 11分析対象成分。 rhein (1), emodin (2), stilbene glycoside (3), glycyrrhizic acid (4), liquiritin (5), liquiritigenin (6), isoliquiritigenin (7), ononin (8), vervascoide (9), gallic acid (10), schisandrin (11) and IS (12). (a) ブランク血漿；(b) 分析対象物質とISを添加したブランク血漿；(c) TMYX抽出物を経口投与した血漿試料。 直線性及び感度

検量線、直線範囲、相関係数及びLLOQの結果をTable 2に示しました。 グリチルリチン酸は8-2000 ng/mL, リキリチンは4-1000 ng/mL, エモジン，没食子酸，オノニン，シサンドリン，スチルベン配糖体は0.8-200 ng/mL, イソキリティゲニン，リキリチゲニン，レイン，バーバスコサイドは 0.4-100 ng/mL という範囲で血漿検量線を構築していた。

y = 2.5769 x + 0.0020 0.4 – 100 0.4 化合物 検量線 相関関係 係数 (r) Linear range (ng/mL) LLOQ (ng/mL) rhein y = 0.0954 x + 1.5911 0.9966 0.4 – 100 0.4 emodin y=1.2189x+0.0135 0.4。9906 0.8 – 200 0.8 stilbene glycoside y = 6.6409 x + 0.0293 0.9991 0.8 – 200 0.8 gallic acid y = 0.9987 x + 0.0104 0.9987 0.8 – 200 0.8 ononin y = 5.4632 x + 0.0058 0.9995 0.8 – 200 0.8.8 verbascoside y = 0.3514 x + 1.9984 0.9965 0.4 – 100 0.4 liquiritin y = 1.1970 x + 0.0085 0.9965 4 – 1000 4 schisandrin y = 2.4 0.0085 4 4 0.9965 0.9980 0.8 – 200 0.8 liquitigenin y = 2.2148 x + 0.0140 0.9997 0.4 – 100 0.4 glycyrrhizic acid y = 0.8 。0917 x – 0.0028 0.9982 8 – 2000 8 isoliquiritigenin y = 3.1496 x + 0.0064 0.9986 0.1

Table 2

分析物の検量線、相関係数、直線範囲およびLLOQを示します。

血漿試料中の11成分のLLOQは8 ng/mL以下であり、薬物動態試験には十分な感度を有していました。 3.3.3. 精度および正確性

本測定法では，3つの濃度レベル，6反復で日内および日中の精度および正確性を分析した。 そのデータをTable 3に示しました。 日内精度と日間精度のRSDは0.7～9.3%であった。 また，精度のREは±14.0%以内であった。 この結果から，本法はラット血漿中の全分析対象成分の分析において，正確で再現性の高い分析法であることが示唆されました。

1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 3.0 ＜6012> 2.01±0.10＜3311> 1.99±0.06 。6 オノニン 1.96±0.04 2.0 1.0 2.00±0.1 0.93±0.08 compounds Spiked Concentration (ng/mL) Intra->Laboratory (Intra->Laboratory)の項参照。day Inter day Measured concentration (ng/mL) Accuracy (RE, 測定濃度（ng/mL） 精度（RSD、%） 精度（RSD、%） rhein 1 1.0 1.0 2.0 2.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.000±0.01 0.5 1.2 0.99±0.01 -1.0 1.0 10 10.16±0.52 1.6 5.1 10.04±0.34 0.5 3.4 100 106.60±1.52 6.6 1.4 101.83±4.74 1.8 4.7 emodin 2 0.0 2.01±0.11＜3311> 0.0 1.0±0.11＞ 1.0±0.11＞ 1.0±0.11＞ 1.0±0.11＞ 4.9 2.00±0.05 0.1 2.7 20 21.72±0.57 8.6 2.6 20.47±1.23 2.3 6.0 200 208.21±1.71 4.1 0.8 201.43±8.99 0.7 4.5 stilbene glycoside 2 -0.4 3.0 2.05±0.03 1.3 1.5 20 20.17±0.76 0.8 3.8 19.91±0.73 -0.5 3.7 200 192.33±2.26 -3.8 1.2 192.80±6.57 -3.6 3.4 gallic acid 2 1.96±0.1 1.4 2.5 1.8 -2.0 2.6 2.06±0.05 3.1 2.4 20 20.00±0.31 0.1 1.6 20.27±0.61 1.4 3.0 200 186.32±1.66 -6.8 0.9 188.68±3.27 -5.7 1.7 2 -1.9 2.0 1.95±0.03 -2.6 1.6> 2.0 2.0> 2.0 20 20.59±0.88 3.0 4.3 19.62±1.09 -1.9 5.6 200 208.21±1.71 4.1 0.8 202.11±5.92 1.1 2.9 verbascoside 1 0.92±0.01＜3311> -7.2＜3311＞ 1.2＜3311＞ 2.4＜3311＞1.5＜33118 1.5 0.96±0.03 -3.9 3.6 10 9.82±0.36 -1.8 3.7 9.66±0.13 -3.4 1.4 100 102.66±2.89 2.7 2.8 102.03±3.01 2.0 3.0 liquiritin 10 9.45±0.08 -5.5 0.8 9.89±0.49 -1.1 4.0> 1.9 100 110.26±3.44 10.3 3.1 109.58±2.85 9.6 2.6 1000 1015.89±23.42 1.6 2.3 990.69±29.65 -0.9 3.0 schisandrin 2 2.6 3.0 3.0> 2.0 2.0 1.0±0.3 3.0 0.2 2.0 1.89±0.06 -5.4 3.4 20 21.49±0.50 7.5 2.3 20.63±0.70 3.2 3.4 200 199.93±2.23 -0.1 1.1 197.48±3.11 -1.3 1.6 liquiritigenin 1 0.86±0.01 -14.0 1.4 -6.2 1.3 -1.3 1.2 0.4 0.3±0.08 1.3 8.5 10 10.37±0.96 3.7 9.3 9.41±0.50 -5.9 5.3 100 106.60±1.52 6.6 1.4 98.95±7.06 -1.1 7.1 glycyrrhizic acid 20 18.0 8.1 1.1 1.4 1.4 1.1 -0.1 2.8 19.21±0.49 -4.0 2.6 200 218.30±1.48 0.1 0.7 199.59±15.20 -0.2 7.6 2000 2123.83±59.62 0.1 2.8 1980.71±75.51 -1.0 3.8 isoliquiritigenin 1 0.98±0.02 -2.1 2.0 3.8 1.8 1.0 2.8 0.98±0.01 -1.6 1.5 10 9.82±0.14 -1.8 1.5 9.72±0.18 -2.8 1.8 100 99.74±0.87 -0.3 0.9 100.71±3.08 0.7 3.1

表3

ラット血漿中の11成分の精度および正確さ（n=6）

3.3.4． 抽出回収率とマトリックス効果

抽出回収率とマトリックス効果の全データを表4にまとめました。 3段階の濃度における11成分の抽出回収率は85.2〜109.1%の範囲であった。 また、全分析対象成分のマトリックス効果は89.2〜113.4%の範囲であった。 このデータは、実験の手順が効率的であり、マトリックス効果を無視できることを表している。

1 emodin 3.5±3.44 3 33 98.2±5.5 成分 添加濃度（ng/mL） 抽出回復率 (%) RSD (%) Matrix effect (%) rhein 96.2±7.4 7.7 104.1±5.6 5.4 10 99.3±3.9 3.9 100.1±2.7 2.7 100 101.4±5.2 5.1 92.6±3.7 4.0 2 3.5 107.7±2.6 2.0 emodin 2.5±3.4 3.5±3.5 4.0±3.0 emodin 20 96.2±2.5 2.6 103.6±0.8 0.8 200 86.1±4.2 4.9 104.8±2.9 2.8 stilbene glycoside 2 98.9±1.9 1.9 100.7±2.2 2.2 20 99.3±4.0 4.0 94.6±2.2 2.3 200 96.7±5.6 5.8 98.7±0.8 0.9 gallic acid 2 99.1±3.1 3.2 110.4±5.8 5.2 20 100.9±2.5 2.5 98.3±2.0 2.0 200 85.2±3.0 3.5 108.1±1.3 1.2 ononin 2 91.8±2.0 2 13 2.9 98.6±2.8 2.8 20 89.0±3.8 4.3 89.9±0.7 0.8 200 93.1±5.2 5.6 91.7±0.9 1.0 verbascoside 1 93.1±4.0 4.3 103.6±3.3 3.3 1.1 10 97.0±4.7 4.8 100.0±2.1 2.1 100 92.5±6.1 6.6 98.9±2.3 2.4 liquiritin 10 105.1 105.7±4.5 4.3 98.8±1.2 1.2 100 109.1±4.0 3.6 100.1±6.4 6.4 1000 99.5±7.6 7.7 95.2±5.5 5.8 schisandrin 2 98.8±4.1 4.2 96.1 98.2±5.5 98.1±4.1 4.2 2.7 20 106.3±1.1 1.0 93.0±1.7 1.8 200 101.0±6.0 5.9 90.4±0.7 0.8 liquiritigenin 1 99.7±3.5 3.6 113.4±2.8 2…5 10 99…5 1 2.5±3.5 2.7 89.2±1.3 1.5 100 96.3±3.4 3.5 99.8±1.8 1.8 glycyrrhizic acid 20 100.9±7.5 7.4 101.6±6.8 6.7 200 97.5±2.1 2.1 102.5±1.3 1.3 2000 87.6±1.6 1.8 103.7±2.1 2.0 isoliquiritigenin 1 98.0±5.5 5.6 105.73±2.2 2.1 10 96.5±2.0 2.1 98.0±3.6 3.6 100 85.9±5.7 6.7 97.3±3.1 3.2

Table 4

分析対象物の抽出回収率とマトリックス効果（n＝6）.

3.3.5. 安定性

分析対象物の安定性を調べるため、異なる保存条件下で3つの濃度レベルのQCサンプルをテストしました。オートサンプラーで準備後12時間、室温で6時間、3回の凍結融解サイクル、および-70℃で14日間保存しました。 その結果、表5に示すように、上記の条件下で分析対象物は安定であることが示唆された。

Rhein、Emodin、Stilbene glycoside、Liquitin、Ononin、Verbascoside、没食子酸およびSchisandrinのTmaxは、0.36±0.31 h, 0.32±0.14 h, 0.50±0.31 h, 0.50±0.46 h, 0.46±0.10 h, 0.37±0.18 h, 0.75±0.67 h, 1.00±0.92 hとなった。 Tmaxは、8成分が速やかに吸収されることを示している。 リキリチゲニン、グリチルリチン酸、イソリクイリチゲニンの平均血漿中濃度時間プロファイルには、ダブルピークが検出された。 3成分の第1ピークは0.20時間、2.13時間、0.28時間に、第2ピークは7.20時間、17.67時間、7.00時間にそれぞれ現れた。 これは、肝・腸管循環に起因するものと考えられる。 グリチルリチン、イソリクイリチン、グリチルリチン酸の血漿中濃度時間プロファイルは、Radix glycyrrhizae または Radix glycyrrhizae と Ramulus cinnamomi の組み合わせで、ラット血漿中に一つのピークが報告された。 この違いは、TMYXに含まれる他のハーブの影響によるものと思われるが、さらなる実験が必要である。 また、Rhein, Emodin, gallic acid, glycyrrhizin, stilbene glycoside, verbascoside, formononetin, schisandrinの消失半減期（t1 / 2）は1.53 h～4.21 hで、これらの8成分はラット血中に速やかに消失することが示唆された。 また、Fructus schisandrae水性抽出物を経口投与した場合、schisandrinは同様の薬物動態を示すことが報告された。 また、Radix polygoni multifloriの処理物をラットに投与した場合、エモジンと没食子酸に1つのピークが観察されることが報告されている。 リキリチゲニン、グリチルリチン酸、イソリキリチゲニンのt1/2は12.70 h、18.19 h、13.0 hであり、リキリチゲニン、グリチルリチン酸、イソリキリチゲニンのt2/3は1.0 hであった。46 hであり、この成分は処理時間が長く、特にイソリクイリチゲニンとグリチルリチン酸は48 hでも生体内で検出できることがわかる

4. 結論

今回の実験では、ラット血漿中のレイン、エモジン、スチルベン配糖体、リキリチン、オノニン、バーバスコサイド、没食子酸、シサンドリン、リキリチゲニン、グリチルリチン酸、イソリキリチゲニンをHPLC-MS/MSで検出する方法を開発しました。 この薬物動態パラメータは，TMYXのさらなる開発および臨床での使用に役立つと思われる。 TMYXの11の有効成分が血漿中に吸収されたことは、品質管理向上のためのデータの裏付けとなる。

Data Availability

この研究の結果を裏付けるために使用したデータは、リクエストに応じて対応する著者から入手できます。

利益相反

著者は利益相反がないことを宣言する。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金（81673824および81503457）および天津市教育委員会研究プロジェクト（2017KJ139）により支援されました。