admin

Abstract

Een gevoelige en betrouwbare HPLC-MS/MS-methode werd ontwikkeld en gevalideerd voor de gelijktijdige bepaling van elf bioactieve verbindingen (rhein, emodine, stilbeenglycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galluszuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur, en isoliquiritigenine) in rattenplasma na orale toediening van Tongmai Yangxin Pil. De verzamelde plasmamonsters werden bereid door vloeistof-vloeistof extractie met ethylacetaat na aanzuren. Elf verbindingen werden gescheiden op een CORTECS™ C18-kolom met mobiele fasen bestaande uit 0,1% mierenzuur in gedeïoniseerd water en acetonitril. De stroomsnelheid was 0,3 mL/min. De detectie werd uitgevoerd op een tandemmassasysteem met een electrospray-ionisatiebron (ESI) in zowel positieve als negatieve ionisatie met meervoudige-reactiemonitoring (MRM) modus. De kalibratiecurven waren lineair over het bereik van 8-2000 ng/mL voor glycyrrhizinezuur; 4-1000 ng/mL voor liquiritine; 0,8-200 ng/mL voor emodine, galluszuur, ononine, schisandrine, en stilbene glycoside; 0,4-100 ng/mL voor isoliquiritigenine, liquiritigenine, rheïne, en verbascoside, respectievelijk. De intra- en interdagprecisie van de analyten was minder dan 9,3% en 8,5%. De intra- en interdagnauwkeurigheid lagen in het bereik van -14,0% tot 10,3% en -6,5% tot 9,6%. Ondertussen varieerde de extractie recovery van de analyten in plasmamonsters van 85,2% tot 109,1% en het matrixeffect van 89,2% tot 113,4%. De ontwikkelde methode werd met succes toegepast op de farmacokinetiek van elf bioactieve verbindingen in rattenplasma na orale toediening van Tongmai Yangxin Pill prescription.

1. Inleiding

Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) is een kostbare schat van de natuur. TCM’s worden al duizenden jaren klinisch gebruikt en trekken steeds meer aandacht vanwege de succesvolle behandeling van diverse ziekten met minimale bijwerkingen. TCM-receptuur, de meest gebruikte vorm in klinische medicatie, heeft multicomponenten en multitargets . De multicomponenten en multitargets zijn de superioriteit en het kenmerk van TCM farmacologische acties.

Tongmai Yangxin Pill (TMYX) is een traditioneel Chinees patentgeneesmiddel dat is gedocumenteerd in de Chinese Farmacopee. Het recept is ontwikkeld op basis van een bekend kruidenpaar “GuiZhi-GanCao” dat in “Shang-Han-Lun” is gedocumenteerd door Zhongjing Zhang in de Oostelijke Han Dynastie. Het recept bestaat uit elf kruiden waaronder Radix rehmanniae, Caulis spatholobi, Radix glycyrrhizae, Ramulus cinnamomi, Radix ophiopogonis, Radix polygoni multiflori preparata, Asini corii colla, Fructus schisandrae, Radix codonopsis, Capapax et Plastrum testudinis, en Fructus jujubae . TMYX wordt al tientallen jaren gebruikt voor de behandeling van coronaire hartziekten, aritmie, pijn op de borst en angina pectoris. Moderne farmacologische studies tonen aan dat TMYX een belangrijk effect heeft op hartziekten. Vier actieve flavonoïde verbindingen (glyasperine A, glycycoumarine, licorisoflavan A, en licoisoflavone A) uit TMYX bleken een bevredigende biologische activiteit te hebben en de proliferatie en angiogenese van menselijke navelstreng endotheelcellen in zebravissen te bevorderen. . Ondertussen meldden Liu et al. dat vijf fracties van TMYX een anti-epitheliale-mesenchymale overgangsactiviteit bleken uit te oefenen. Uit de resultaten van Tao blijkt dat zes actieve bestanddelen met hoge R-waarden (gomisine D, schisandrine, glycyrrhizinezuur, stilbeenglycoside, formononetine en ononine) op dosisafhankelijke wijze ontstekingsremmende effecten uitoefenen.

De farmacologische effecten van TMYX zijn gebaseerd op de uiteenlopende chemische samenstelling. Chen rapporteerde 80 verbindingen werden geïdentificeerd of vermoed met behulp van HPLC-MS, waaronder 23 flavonen en hun glucuroniden, 6 fenethyl alcohol glycosiden, 20 triterpeen saponinen, 15 lignanen, en 18 andere verbindingen . Fan karakteriseerde 40 geabsorbeerde bioactieve componenten na orale toediening van TMYX in rattenserum door UPLC/Q-TOF-MS . De 40 bestanddelen, waaronder 2 uit Radix rehmanniae, 10 uit Radix codonopsis, 2 uit Radix ophiopogonis, 2 uit Ramulus cinnamomi, 19 uit Radix glycyrrhizae, 2 uit Radix polygoni multiflori preparata, 5 uit Caulis spatholobi, 1 uit Fructus jujubae, en 1 uit Fructus schisandrae, waarvan sommige elkaar overlappen. De meeste ingrediënten hebben een ontstekingsremmende en antioxiderende werking en hebben bovendien een cardiovasculair beschermend effect. Het team bepaalt ook de concentraties van liquiritine, liquiritigenine, isoliquiritigenine, glycyrrhizinezuur en glycyrrhetinezuur in rattenplasma na orale toediening van Radix glycyrrhizae of de combinatie van Radix glycyrrhizae en Ramulus cinnamomi door HPLC-UV. Er is echter geen publicatie die de farmacokinetische studie van TMYX rapporteert.

Pharmacokinetiek (PK) van TCMs is een tak van de farmacologie van TCMs. PK van TCMs richt zich op kwantitatieve studies van de wetten van geneesmiddelabsorptie, distributie, metabolisme, en uitscheiding in een levend organisme. PK studie van multicomponenten van TCM recept is een van de belangrijke onderzoeksaspecten van de modernisering van TCMs. De PK gegevens kunnen de substantiebasis verduidelijken en de wetenschappelijke connotatie van TCMs onthullen. Het speelt ook een belangrijke rol in de creatie van nieuwe Chinese geneesmiddelen, de verbetering van doseringsvormen, en het mechanisme van formulering mechanisme. In de huidige studie werd eerst een betrouwbare en gevoelige HPLC-MS/MS methode ontwikkeld en toegepast op de farmacokinetische studie van 11 bioactieve componenten waaronder rheïne, emodine, stilbeenglycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galluszuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur en isoliquiritigenine bij ratten na orale toediening van TMYX. De farmacokinetische kenmerken van de belangrijkste chemische bestanddelen van TMYX bij ratten werden onthuld, wat een theoretische basis zou vormen voor het gebruik van TMYX in de kliniek.

2. Experimenteel

2.1. Chemische stoffen, reagentia en materialen

Methanol (chromatografische zuiverheid) en acetonitril (chromatografische zuiverheid) werden gekocht bij Merck Co., Ltd. Mierenzuur (chromatografische zuiverheid) werd verkregen van ROE Co., Ltd. Ultrazuiver water werd bereid met een Milli-Q waterzuiveringssysteem (Millipore, Milford, MA, USA). Rhein, emodin, stilbeenglycoside, liquiritin, ononin, verbascoside, galluszuur, schisandrin, liquiritigenin, glycyrrhizinezuur, isoliquiritigenin, en icariin werden aangekocht bij Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). (Chengdu, China). TMYX werden geleverd door Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co, Ltd.

2.2. 2.2. Chromatografische en massaspectrometriecondities

Het HPLC-MS/MS-systeem bestaat uit een Agilent 1200 high-performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan een Aglient 6430 serie triple quadrupool massaspectrometer met een electrospray ionisatie (ESI) bron. De chromatografische scheiding werd gerealiseerd op een CORTECS C18-kolom (4,6 mm × 150 mm, 2,7 μm), en de kolomtemperatuur werd op 30°C gehouden. Mobiele fasen die bestonden uit 0,1% mierenzuur in water (A) en acetonitril (B) werden gebruikt in de volgende gradiënt-elutiemethode: 0-10 min, 10%-85% B; 10-13 min, 85%-95% B; 13-19 min, 95%-95% B. De stroomsnelheid werd ingesteld op 0,3 mL/min, en het injectievolume was 10 μL. Alle gegevens werden geanalyseerd door Mass Hunter werkstation software (Agilent Technologies, USA).

De massaspectrometer werd uitgevoerd in zowel positieve als negatieve ionisatie multiple-reaction monitoring (MRM) modus. De bronparameters waren als volgt: de capillaire spanning werd ingesteld op 300 V voor de positieve ionisatiemodus en -300 V voor de negatieve ionisatiemodus, de temperatuur van het drooggas was 320°C, het debiet was 11 L/min, en de vernevelingsgasdruk was 30 psi. De precursor en productie van de ingrediënten en MRM-parameters werden weergegeven in tabel 1.

Compounds Precursor Ion (m/z) Product Ion (m/z) Frag. (V) C.E. (V)
rhein 238.9 211.0 140 -10
emodin 269.0 225.0 145 -20
stilbene glycoside 405.2 242.8 145 -13
liquiritine 417.1 255.0 145 -13
ononine 431.2 269.1 10 13
verbascoside 623.0 161.1 116 -33
galluszuur 169.0 125.1 123 -12
schisandrine 433,3 384,2 100 14
liquiritigenine 255,3 119.1 121 -24
glycyrrhizinezuur 821.1 350.5 125 -40
isoliquiritigenine 255.1 118.9 106 -23
icariine (IS) 721.0 513.2 145 -10
Tabel 1
Massaspectra eigenschappen van 11 analyten en IS.
2.3. Bereiding van TMYX-extract

TMYX-extract werd als volgt bereid: In totaal werd 100 g TMYX-poeder nauwkeurig afgewogen en tweemaal onder warmterugvloeiing geëxtraheerd met viermaal 60% ethanol (v/v) gedurende 1 uur per keer. Daarna werden de extractieoplossingen gefiltreerd en gemengd. De gemengde oplossing werd geconcentreerd door verdamping onder verminderde druk. Vervolgens werden de gedroogde extracten tot poeder vermalen en tot de analyse in een exsiccator bewaard. De extracten bevatten rheïne, emodine, stilbeenglycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galluszuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur, en isoliquiritigenine respectievelijk 0,4, 46,3, 231,6, 270,5, 161,1, 27,8, 71,8, 65,2, 16,9, 519,7, en 9,6 μg/g. De structuren van de verbindingen in het onderzoek werden getoond in figuur 1.

Figuur 1
Chemische structuren van elf componenten.
2.4. Voorbereiding van ijkoplossingen en kwaliteitscontrolemonsters

Om de stamoplossing te maken werden rheïne, emodine, stilbeenglycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galluszuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur, isoliquiritigenine en icariine (interne standaardoplossing) afzonderlijk afgewogen en met methanol verdund tot een eindconcentratie van 1 mg/ml. De gemengde standaardoplossing werd verkregen door het juiste volume van elf stamoplossingen te mengen en te verdunnen met methanol.

De ijkoplossingen werden bereid door 20 μl van het mengsel standaardoplossing en 20 μl van IS in 100 μl blanco rattenplasma te spikken. De uiteindelijke concentraties van de serie analyten waren in het bereik van 8-2000 ng/mL voor glycyrrhizinezuur; 4-1000 ng/mL voor liquiritine; 0,8-200 ng/mL voor emodin, galluszuur, ononine, schisandrine, en stilbene glycoside; en 0,4-100 ng/mL voor isoliquiritigenine, liquiritigenine, rhein, en verbascoside.

Kwaliteitscontrole (QC) monsters in drie concentraties (lage, gemiddelde en hoge concentratie) werden samengesteld uit passende gemengde standaardoplossingen met blanco bloedmonster als ijkoplossingen om aan de vereiste concentraties te voldoen. Alle oplossingen werden bewaard bij 4°C.

2.5. Plasmamonsterbereiding

Het plasma (100 μl) werd verrijkt met 20 μl methanol, 20 μl IS (icariine, 1 μg/mL) en 20 μl mierenzuur en vervolgens vortex-gemengd. Het mengsel werd geëxtraheerd met 800 pi ethylacetaat door vortexmenging gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie bij 14.000 rpm gedurende 10 min werd het supernatans opgevangen in een schone buis en onder een stikstofstroom ingedampt tot droogte. Het residu werd gereconstitueerd in 50 μl 50% methanol, 5 min. vortexen en 10 min. centrifugeren bij 14.000 rpm. Ten slotte werd 10 μl supernatant in het LC-MS/MS-systeem geïnjecteerd voor analyse.

2.6. Methodevalidatie
2.6.1. Specificiteit

De specificiteit werd beoordeeld door analyse van blanco bloedmonsters van zes verschillende ratten. Elk plasmamonster werd geëvalueerd op endogene interferentie met gebruikmaking van het voorgestelde extractieprogramma en de LC-MS/MS-condities hierboven.

2.6.2. Lineariteit en LLOQ

De lineariteit werd bereikt door het testen van blanco rattenplasma met een ernstige van de gemengde standaardoplossing en IS in duplo gedurende 3 opeenvolgende dagen. De ijkcurven werden uitgezet door de piek-oppervlakteverhoudingen (y) van analyt tegen interne standaard af te zetten tegen de nominale concentratie (x). De gewichtsfactor is 1/x. De ondergrens van de kwantificering (LLOQ) werd beoordeeld aan de hand van de basisruis, waarbij een signaal/ruisverhouding van ongeveer 10 werd vastgesteld. Nauwkeurigheid en nauwkeurigheid

De nauwkeurigheid en nauwkeurigheid werden beoordeeld door het bepalen van QC monsters bij lage, gemiddelde en hoge concentraties (20, 200, en 2000 ng/mL voor glycyrrhizinezuur; 10, 100 en 1000 ng/mL voor liquiritine; 2, 20 en 200 ng/mL voor emodine, galluszuur, ononine, schisandrine en stilbeenglycoside; 1, 10 en 100 ng/mL voor isoliquiritigenine, liquiritigenine, rheïne en verbascoside). Alle concentratieniveaus werden in zes replicaten gemeten. De precisie en de nauwkeurigheid werden eenmaal per dag getest en gedurende drie opeenvolgende dagen herhaald met de standaardijkkromme. De intra- en interdagprecisie werden gedefinieerd als de relatieve standaardafwijking (RSD), terwijl de nauwkeurigheid werd bepaald door de relatieve fout (RE %).

2.6.4. Extractieterugvinding en Matrixeffect

De extractieterugvinding van elf analyten op drie concentratieniveaus en IS werden bepaald door de piekoppervlakken van geëxtraheerde monsters te vergelijken met die van de nageëxtraheerde monsters. Het matrixeffect van de monsters en IS werden geschat aan de hand van de piekvlakratio’s van de analyten in achteraf geëxtraheerde monsters en die van niet-geëxtraheerde monsters. Zowel de terugvinding door extractie als het matrixeffect werden getest in zes parallelle onderzoeken.

2.6.5. Stabiliteit

De stabiliteit van analyten in plasmamonsters werd bepaald door QC-monsters van drie concentratieniveaus onder verschillende omstandigheden te analyseren: 12 uur opgeslagen in autosampler, 6 uur bij kamertemperatuur, onder drie vries-dooicycli en 14 dagen bewaard bij -70°C. Alle stabiliteitsstudies werden gemeten in zes replicaten.

2.7. Farmacokinetische Studie

Mannelijke Sprague-Dawley ratten (230-250 g) werden verkregen van Beijing HFK Experimental Animal Technology Co., Ltd. De ratten werden gehouden onder gecontroleerde milieu-omstandigheden en ze vastten gedurende 12 uur met vrije toegang tot water vóór de experimenten. TMYX-extracten werden opgelost in CMC-Na en oraal toegediend aan de ratten in een dosis van 8,3 g/kg. De bloedmonsters (200 μL) werden verzameld uit de fossa orbitalis ader van de rat op 0, 0,03, 0,083, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, en 48 uur na orale toediening in gehepariniseerde buisjes. Daarna werden de bloedmonsters gecentrifugeerd bij 7.000 rpm gedurende 10 min om onmiddellijk het plasmamonster te verkrijgen. Ten slotte werd het verkregen plasma tot de analyse bij -70°C bewaard. De farmacokinetische parameters werden berekend met het computerprogramma “Drug and Statistics 2.0” (DAS 2.0) (Medisch College van Wannan, China).

3. Resultaat en Discussie

3.1. HPLC-MS/MS Methode

Er werden verschillende mobiele fasen getest. In vergelijking met een gradiënt mobiel fasesysteem met acetonitril-water of methanol-water, kon de mobiele fase met 0,1% mierenzuur in water de piekvorm verbeteren en de signaalrespons van de analyten verhogen. Daarom werd gekozen voor water met 0,1% mierenzuur als mobiele fase.

De standaardoplossingen van respectievelijk de analyten en de interne standaard werden in de massaspectrometer geïnjecteerd. De ononine en schisandrine werden getest in positieve ion mode, terwijl de anderen in negatieve. De geoptimaliseerde overgangen van precursor naar productie werden gecontroleerd op 238,9→211,0 voor rheïne, 269,0→225,0 voor emodïne, 405,2→242,8 voor stilbenenglycoside, 417,1→255,0 voor liquiritine, 431,2→269,1 voor ononine, 623.0→161,1 voor verbascoside, 169,0→125,1 voor galluszuur, 433,3→384,2 voor schisandrine, 255,3→119,1 voor liquiritigenine, 821,1→350,5 voor glycyrrhizinezuur, 255,1→118,9 voor isoliquiritigenine, en 721,0→513,2 voor IS. Alle gegevens zijn vermeld in tabel 1.

3.2. Monstervoorbereiding

In het experiment testten we twee methoden om het plasmamonster te verwijderen, waaronder vloeistof-vloeistofextractie (LLE) en eiwitprecipitatie (PPT). De resultaten tonen aan dat zowel de terugwinning als de matrixeffecten van de methoden voldoen aan de eisen voor de bepaling van biologische monsters en dat de endogene stoffen niet interfereren met de analyse. De methode van PPT vertoonde echter een lagere extractie-efficiëntie en relatief een hoger matrixeffect. Bijgevolg hebben wij gekozen voor vloeistof-vloeistof extractie (LLE) met ethylacetaat om het monster te bereiden.

3.3. Methodevalidatie
3.3.1. Specificiteit

De specificiteit werd geschat door chromatogrammen van blanco bloedmonsters van zes verschillende ratten te vergelijken met bloedmonsters die analyten bevatten. De representatieve chromatogrammen van blanco bloedmonster, blanco bloedmonster met elf analyten en IS, en plasmamonster verkregen van een rat na orale toediening van TMYX-extracten werden bekeken. De retentietijden van rheïne, emodine, stilbeenglycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galluszuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur, isoliquiritigenine, en IS waren respectievelijk 15,93, 17,63, 11,34, 11,31, 12,21, 11,01, 6,48, 16,41, 13,21, 13,34, 14,41, en 12,19 min. Uit de chromatogrammen blijkt dat endogene stoffen in plasmamonsters niet interfereren met de bepaling van analyten en IS. De chromatogrammen zijn weergegeven in figuur 2.


(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 2
MRM chromatogrammen van elf analyten. rheïne (1), emodine (2), stilbeenglycoside (3), glycyrrhizinezuur (4), liquiritine (5), liquiritigenine (6), isoliquiritigenine (7), ononine (8), verbascoside (9), galluszuur (10), schisandrine (11), en IS (12). (a) Blanco plasma; (b) blanco plasma vermengd met de analyten en IS; (c) plasmamonster na orale toediening van TMYX-extract.

3.3.2. De resultaten van de ijkkrommen, lineaire bereiken, correlatiecoëfficiënten en LLOQ’s werden weergegeven in tabel 2. De plasma-ijkcurven werden geconstrueerd binnen het bereik van 8-2000 ng/mL voor glycyrrhizinezuur; 4-1000 ng/mL voor liquiritine; 0,8-200 ng/mL voor emodine, galluszuur, ononine, schisandrine, en stilbeenglycoside; 0,4-100 ng/mL voor isoliquiritigenine, liquiritigenine, rheïne, en verbascoside.

Compounds Calibratiecurven Correlatie coëfficiënten (r) Lineair bereik (ng/mL) LLOQ (ng/mL)
rhein y = 0.0954 x + 1.5911 0.9966 0.4 – 100 0.4
emodin y = 1.2189 x + 0.0135 0.9906 0.8 – 200 0.8
stilbenenglycoside y = 6.6409 x + 0.0293 0.9991 0.8 – 200 0.8
galvanzuur y = 0.9987 x + 0.0104 0.9987 0.8 – 200 0.8
onononine y = 5.4632 x + 0.0058 0.9995 0.8 – 200 0.8
verbascoside y = 0.3514 x + 1.9984 0.9965 0.4 – 100 0.4
liquiritin y = 1.1970 x + 0.0085 0.9965 4 – 1000 4
schisandrine y = 2.5769 x + 0.0020 0.9980 0.8 – 200 0.8
liquiritigenine y = 2.2148 x + 0.0140 0.9997 0.4 – 100 0.4
glycyrrhizinezuur y = 0.0917 x – 0,0028 0,9982 8 – 2000 8
isoliquiritigenine y = 3,1496 x + 0,0064 0,9986 0,4 – 100 0,4 – 100
isoliquiritigenine 0.4
Tabel 2
Calibratiekrommen, correlatiecoëfficiënten, lineaire bereiken, en LLOQ van de analyten.

De LLOQ’s voor 11 analyten in plasmamonsters waren lager dan 8 ng/mL, wat gevoelig genoeg is voor de farmacokinetische studies.

3.3.3. Precisie en Nauwkeurigheid

In deze assay werden de intra- en interdag precisie en nauwkeurigheid geanalyseerd op drie concentratieniveaus in zes herhalingen. De gegevens werden weergegeven in tabel 3. De RSD van intra- en interday precisie lagen tussen 0,7 en 9,3%. De RE van nauwkeurigheid lag binnen ±14,0%. De resultaten suggereren dat de methode nauwkeurig en herhaalbaar is voor analyse van alle analyten in rattenplasma.

verbindingen Spiked Concentratie (ng/mL) Intra-dag Inter-dag
Gemeten concentratie (ng/mL) Nauwkeurigheid (RE, %) Precisie (RSD, %) Gemeten concentratie (ng/mL) Nauwkeurigheid (RE, %) Precisie (RSD, %)
rhein 1 1.00±0.01 0.5 1.2 0.99±0.01 -1.0 1.0
10 10.16±0.52 1.6 5.1 10.04±0.34 0.5 3.4
100 106.60±1.52 6.6 1.4 101.83±4.74 1.8 4.7
emodin 2 2.01±0.10 0.3 4.9 2.00±0.05 0.1 2.7
20 21.72±0.57 8.6 2.6 20.47±1.23 2.3 6.0
200 208.21±1.71 4.1 0.8 201.43±8.99 0.7 4.5
stilbene glycoside 2 1.99±0.06 -0.4 3.0 2.05±0.03 2.3 1.6
20 20.17±0.76 0.8 3.8 19.91±0.73 -0.5 3.7
200 192.33±2.26 -3.8 1.2 192.80±6.57 -3.6 3.4
galluszuur 2 1.96±0.05 -2.0 2.6 2.06±0.05 3.1 2.4
20 20.00±0.31 0.1 1.6 20.27±0.61 1.4 3.0
200 186.32±1.66 -6.8 0.9 188.68±3.27 -5.7 1.7
ononine 2 1.96±0.04 -1.9 2.0 1.95±0.03 -2.6 1.4
20 20.59±0.88 3.0 4.3 19.62±1.09 -1.9 5.6
200 208.21±1.71 4.1 0.8 202.11±5.92 1.1 2.9
verbascoside 1 0.92±0.01 -7.8 1.5 0.96±0.03 -3.9 3.6
10 9.82±0.36 -1.8 3.7 9.66±0.13 -3.4 1.4
100 102.66±2.89 2.7 2.8 102.03±3.01 2.0 3.0
liquiritine 10 9.45±0.08 -5.5 0.8 9.89±0.49 -1.1 4.9
100 110.26±3.44 10.3 3.1 109.58±2.85 9.6 2.6
1000 1015.89±23.42 1.6 2.3 990.69±29.65 -0.9 3.0
schisandrin 2 2.00±0.04 0.2 2.0 1.89±0.06 -5.4 3.4
20 21.49±0.50 7.5 2.3 20.63±0.70 3.2 3.4
200 199.93±2.23 -0.1 1.1 197.48±3.11 -1.3 1.6
liquiritigenine 1 0.86±0.01 -14.0 1.4 0.93±0.08 -6.5 8.5
10 10.37±0.96 3.7 9.3 9.41±0.50 -5.9 5.3
100 106.60±1.52 6.6 1.4 98.95±7.06 -1.1 7.1
glycyrrhizinezuur 20 18.72±0.53 -0.1 2.8 19.21±0.49 -4.0 2.6
200 218.30±1.48 0.1 0.7 199.59±15.20 -0.2 7.6
2000 2123.83±59.62 0.1 2.8 1980.71±75.51 -1.0 3.8
isoliquiritigenine 1 0.98±0.02 -2.1 2.1 0.98±0.01 -1.6 1.5
10 9.82±0.14 -1.8 1.5 9.72±0.18 -2.8 1.8
100 99.74±0.87 -0.3 0.9 100.71±3.08 0.7 3.1
Tabel 3
Precisie en nauwkeurigheid van 11 analyten in rattenplasma (n=6).
3.3.4. Extractieterugwinning en matrixeffect

Alle gegevens van de extractieterugwinning en het matrixeffect werden samengevat in tabel 4. De terugvinding van de extractie van 11 bestanddelen bij drie concentratieniveaus lag tussen 85,2-109,1%. De matrixeffecten van alle analyten varieerden van 89,2 tot 113,4%. Uit de gegevens blijkt dat de procedure van het experiment efficiënt is en dat de matrixeffecten konden worden genegeerd.

Compounds Spiked concentratie (ng/mL) Extractieherwinning (%) RSD (%) Matrix effect (%) RSD (%)
rhein 1 96.2±7.4 7.7 104.1±5.6 5.4
10 99.3±3.9 3.9 100.1±2.7 2.7
100 101.4±5.2 5.1 92.6±3.7 4.0
emodin 2 98.8±3.4 3.5 107.7±2.6 2.4
20 96.2±2.5 2.6 103.6±0.8 0.8
200 86.1±4.2 4.9 104.8±2.9 2.8
stilbene glycoside 2 98.9±1.9 1.9 100.7±2.2 2.2
20 99.3±4.0 4.0 94.6±2.2 2.3
200 96.7±5.6 5.8 98.7±0.8 0.9
galvanzuur 2 99.1±3.1 3.2 110.4±5.8 5.2
20 100.9±2.5 2.5 98.3±2.0 2.0
200 85.2±3.0 3.5 108.1±1.3 1.2
ononine 2 91.8±2.7 2.9 98.6±2.8 2.8
20 89.0±3.8 4.3 89.9±0.7 0.8
200 93.1±5.2 5.6 91.7±0.9 1.0
verbascoside 1 93,1±4,0 4,3 103,6±3,3 3.1
10 97.0±4.7 4.8 100.0±2.1 2.1
100 92.5±6.1 6.6 98.9±2.3 2.4
liquiritin 10 105.7±4.5 4.3 98.8±1.2 1.2
100 109.1±4.0 3.6 100.1±6.4 6.4
1000 99.5±7.6 7.7 95.2±5.5 5.8
schisandrine 2 98.8±4.1 4.2 96.8±2.6 2.7
20 106.3±1.1 1.0 93.0±1.7 1.8
200 101.0±6.0 5.9 90.4±0.7 0.8
liquiritigenine 1 99,7±3,5 3,6 113,4±2,8 2,5
10 99.5±2.7 2.7 89.2±1.3 1.5
100 96.3±3.4 3.5 99.8±1.8 1.8
glycyrrhizinezuur 20 100.9±7.5 7.4 101.6±6.8 6.7
200 97.5±2.1 2.1 102.5±1.3 1.3
2000 87.6±1.6 1.8 103.7±2.1 2.0
isoliquiritigenine 1 98,0±5,5 5,6 105,73±2,2 2.1
10 96.5±2.0 2.1 98.0±3.6 3.6
100 85.9±5.7 6.7 97.3±3.1 3.2
Tabel 4
Extractieterugwinningen en matrixeffecten van de analyten (n=6).
3.3.5. Stabiliteit

Om de stabiliteit van analyten te onderzoeken, werden QC-monsters van drie concentratieniveaus onder verschillende opslagomstandigheden getest, waaronder opslag in autosampler gedurende 12 uur na bereiding, bij kamertemperatuur gedurende 6 uur, bij drie vries-dooi cycli, en bij -70°C gedurende 14 dagen. Zoals blijkt uit tabel 5, wijzen de resultaten erop dat de analyten stabiel zijn in de bovengenoemde omstandigheden.

Verstrekte concentratie (ng/mL) ruimtetemperatuur gedurende 6 uur drie vries-dooicycli auto-sampler gedurende 12 uur -70°C gedurende 14 dagen
Gemeten concentratie (ng mL-1) RSD (%) Gemeten concentratie (ng mL-1) RSD (%) Gemeten Concentratie (ng mL-1) RSD (%) Gemeten Concentratie (ng mL-1) RSD (%)
rhein 1 0.97±0.02 2.0 0.98±0.03 2.8 0.97±0.01 0.8 0.95±0.05 5.4
10 10.23±0.04 0.4 8.89±0.08 0.9 9.86±0.09 0.9 8.71±0.11 1.3
100 101.97±1.07 1.1 86.7±1.33 1.5 97.32±1.05 1.1 85.95±0.39 0.5
emodin 2 1.95±0.05 2.3 2.00±0.02 0.9 1.93±0.02 0.8 1.86±0.03 1.6
20 21.14±0.99 4.7 19.21±0.33 1.7 19.88±1.81 9.1 18.79±0.18 0.9
200 207.49±1.27 0.6 197.74±5.65 2.9 200.50±11.66 5.8 185.45±0.98 0.5
stilbenenglycoside 2 1,82±0,01 0,8 2.00±0.03 1.6 1.89±0.00 0.1 1.99±0.01 0.3
20 20.88±1.19 5.7 19.87±1.43 7.2 19.00±0.64 3.4 20.01±0.31 1.6
200 202.79±12.80 6.3 200.45±2.10 1.1 182.40±1.23 0.7 203.34±1.39 0.7
galvanzuur 2 1.97±0.03 1.5 1.93±0.04 1.8 2.03±0.05 2.3 1.99±0.04 2.0
20 20.77±1.09 5.3 20.08±0.51 2.5 19.27±0.35 1.8 19.26±0.22 1.2
200 205.97±2.14 1.0 196.77±1.09 0.6 184.54±2.46 1.3 199.19±1.80 0.9
ononine 2 2.02±0.03 1.4 1.85±0.01 0.7 1.83±0.01 0.4 1.95±0.01 0.5
20 20.57±0.26 1.2 18.71±0.26 1.4 18.84±0.62 3.3 18.51±0.15 0.8
200 216.32±0.91 0.4 191.28±2.36 1.2 195.34±4.30 2.2 200,23±3,89 1,9
verbascoside 1 0,92±0.01 1.0 1.09±0.01 0.9 1.05±0.02 1.8 1.01±0.02 2.3
10 9.57±0.21 2.2 10.17±0.90 8.9 9.50±0.04 0.5 9.81±0.22 2.2
100 103.95±1.33 1.3 108.42±1.17 1.1 93.52±0.27 0.3 107.40±1.47 1.4
liquiritin 10 9.85±0.09 1.0 9.26±0.16 1.7 10.26±0.11 1.1 10.04±0.12 1.2
100 108.97±1.51 1.4 109.67±1.86 1.7 108.02±0.66 0.6 105.05±1.73 1.7
1000 1076.07±10.27 1.0 952.89±11.22 1.2 869.12±14.52 1.7 1021.69±19.98 2.0
schisandrine 2 2.00±0.04 1.8 1.71±0.01 0.6 1.83±0.02 1.1 1.77±0.03 1.7
20 21.15±0.50 2.4 18.28±0.23 1.2 18.35±0.09 0.5 17.86±0.20 1.1
200 194.61±1.13 0.6 189.32±1.74 0.9 196.02±2.10 1.1 183.83±1.00 0.6
liquiritigenine 1 0,87±0,01 0,9 0,89±0,02 1.8 0.87±0.01 1.1 0.88±0.02 2.1
10 10.82±0.58 5.3 8.99±0.07 0.8 8.63±0.23 2.7 9.26±0.08 0.9
100 112.69±1.30 1.2 92.59±0.63 0.7 92.65±0.68 0.7 91.88±0.86 0.9
glycyrrhizinezuur 20 20,49±0,79 3,9 19.30±0.20 1.0 19.25±0.34 1.8 18.77±0.09 0.5
200 203.22±3.32 1.6 188.63±3.57 1.9 200.96±3.93 2.0 200.33±2.98 1.5
2000 2099.10±8.92 0.4 1869.00±42.55 2.3 1884.66±9.26 0.5 1834.54±29.34 1.6
isoliquiritigenine 1 0.99±0.01 1.5 0.89±0.02 2.4 1.00±0.02 1.7 0.89±0.01 1.4
10 10.86±0.60 5.5 8.69±0.14 1.6 9.60±0.04 0.4 8.62±0.04 0.4
100 106.11±0.78 0.7 100.58±0.91 0.9 97.47±1.99 2.0 100,74±2,95 2,9
Tabel 5
Stabiliteit van alle analyten in rattenplasma (n=6).

3.4. De gevalideerde LC-MS/MS-methode werd toegepast op de farmacokinetische studie van de elf analyten in bloedmonsters van ratten na orale toediening van TMYX in een eenmalige dosis van 8,3 g/kg. De belangrijkste farmacokinetische parameters zijn weergegeven in tabel 6. En de gemiddelde plasmaconcentratie-tijdprofielen van de elf werkzame bestanddelen werden getoond in figuur 3.

99.1±27.1

Compounds Tmax1 (h) Tmax2 (h) Cmax1 (ng/mL) Cmax2 (ng/mL) t1/2 (h) Ke (1/h) (h-ng/mL)
rhein 0.36±0.31 46.3±15.6 2.84±2.13 0.56±0.50 145.0±52.6 152.1±61.3
emodine 0.32±0.14 88.0±37.5 4.21±2.63 0.39±0.28 475.5±121.0 561.3±192.3
stilbenenglycoside 0.50±0.31 1.99±1.31 0.45±0.24 283.8±189.1 297.5±185.3
liquiritine 0.50±0.46 199.9±120.2 2.16±1.44 0.77±0.54 637.2±220.2 651.1±219.5
ononine 0.46±0.10 14.4±6.8 2.85±1.40 0.37±0.25 58.2±20.2 69.4±28.5
verbascoside 0.37±0.18 23.4±8.7 1.53±0.67 0.56±0.31 51.4±29.8 61.0±29.8
galuszuur 0.75±0.67 56.9±42.8 3.01±1.35 0.27±0.12 214,7±136,7 238,4±172,8
schisandrine 1,00±0.92 92.6±53.0 2.73±1.54 0.34±0.19 410.8±238.9 473.4±321.2
liquiritigenine 0.20±0.07 7.20±3.35 37.8±24.1 21.0±15.3 12.70±7.04 0.50±0.34 314.8±129.8 332.6±142.1
glycyrrhizinezuur 2.13±1.44 17.67±10.31 351.7±347.4 476.1±146.0 18.19±9.61 0.05±0.03 12743.5±5058.2 17327.3±10967.3
isoliquiritigenine 0.28±0.11 7.00±2.45 41.6±24.2 24.9±13.5 13.46±8.33 0.07±0.04 410.0±130.7 436.2±154.1
Tabel 6
Pharmacokinetische parameters van 11 analyten na orale toediening van TMYX-extract (n=6).
Figuur 3
Gemiddelde plasmaconcentratie-tijd curven van rheïne, emodine, stilbene glycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galzuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur en isoliquiritigenine na orale toediening van TMYX-extract (gemiddelde ± SD, n=6).

De Tmax van rheïne, emodine, stilbeenglycoside, liquiritine, ononine, verbascoside, galluszuur, en schisandrine zijn 0.36±0,31 uur, 0,32±0,14 uur, 0,50±0,31 uur, 0,50±0,46 uur, 0,46±0,10 uur, 0,37±0,18 uur, 0,75±0,67 uur, en 1,00±0,92 uur, respectievelijk. De Tmax toont aan dat acht ingrediënten snel worden geabsorbeerd. Er worden dubbele pieken gedetecteerd in de gemiddelde plasmaconcentratie-tijdprofielen voor liquiritigenine, glycyrrhizinezuur en isoliquiritigenine. De eerste piek van drie ingrediënten verscheen om 0,20 uur, 2,13 uur en 0,28 uur en de tweede piek om respectievelijk 7,20 uur, 17,67 uur en 7,00 uur. Deze zou het gevolg kunnen zijn van de hepatoenterale circulatie. Er werden verschillende plasmaconcentratie-tijdprofielen van liquiritigenine, isoliquiritigenine, en glycyrrhizinezuur gerapporteerd in rattenplasma na orale toediening van Radix glycyrrhizae of de combinatie van Radix glycyrrhizae en Ramulus cinnamomi . De verschillen kunnen het gevolg zijn van de effecten van andere kruiden in TMYX, waarvoor verdere experimenten nodig zijn. Naast dubbele pieken varieert de eliminatiehalfwaardetijd (t1 /2) van rheïne, emodine, galluszuur, glycyrrhizine, stilbeenglycoside, verbascoside, formononetine en schisandrine van 1,53 uur tot 4,21 uur, wat suggereert dat deze acht analyten in bloedmonsters van ratten snel worden geëlimineerd na orale toediening. Dezelfde farmacokinetische trend van schisandrine werd gerapporteerd na orale toediening van Fructus schisandrae waterig extract. Ook werd gerapporteerd dat één piek werd waargenomen voor emodine en galluszuur bij ratten die verwerkte Radix polygoni multiflori toegediend kregen. De t1 /2 van de liquiritigenine, glycyrrhizinezuur, en isoliquiritigenine zijn 12,70 h, 18,19 h, en 13.46 h, wat erop wijst dat het ingrediënt een langere behandelingstijd heeft, vooral isoliquiritigenine en glycyrrhizinezuur, die na 48 h nog in vivo kunnen worden gedetecteerd.

4. Conclusie

In ons experiment, ontwikkelden wij een methode van HPLC-MS/MS voor het opsporen van de rhein, emodin, stilbeen glycoside, liquiritin, ononin, verbascoside, galluszuur, schisandrine, liquiritigenine, glycyrrhizinezuur, en isoliquiritigenine in rattenplasma. De farmacokinetische parameters zouden nuttig zijn voor de verdere ontwikkeling en het klinische gebruik van TMYX. De 11 actieve bestanddelen van TMYX, die in plasma werden geabsorbeerd, zouden gegevens opleveren ter ondersteuning van de verbetering van de kwaliteitscontrole.

Beschikbaarheid van gegevens

De gegevens die werden gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door National Natural Science Foundation of China (81673824 en 81503457) en Tianjin Municipal Education Commission Research Project (2017KJ139).

admin

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.

lg